T.C
         PAMUKKALE ÜNİVERSİTESİ
                  TIP FAKÜLTESİ
MİKROBİYOLOJİ VE KLİNİK MİKROBİYOLOJİ
                ANABİLİM DALI
BESİCİLERDE VANKOMİSİNE DİRENÇLİ ENTEROKOK ARAŞTIRILMASI
UZMANLIK TEZİ
DR. ERGUN METE
DENIZLI-2003
TEŞEKKÜR

Uzmanlık eğitimim süresince destek ve ilgilerini esirgemeyen, bilgi ve deneyimlerinden yararlandığım ve tezimin tüm aşamalarında beni yönlendiren, katkıda bulunan hocam ve tez danışmanım sayın Doç Dr İlknur KALELİ’ye sonsuz teşekkürlerimi sunarım. 
Uzmanlık eğitimime katkılarından dolayı Yard Doç Dr Mustafa ŞENGÜL, Yard Doç Dr Nural CEVAHİR, Yard Doç Dr Melek DEMİR ve Yard Doç Dr Çağrı ERGİN’e çok teşekkür ederim. Tezimin çalışma aşamasındaki katkılarından dolayı asistan arkadaşlarım Dr Süal ÖZTÜRK, Dr Yusuf POLAT, Dr Umut YILDIRIM ve biolog Nesrin BULUŞ’a çok teşekkür ederim. Ayrıca emeği geçen tüm laboratuvar çalışanlarına içtenlikle teşekkür ederim.

İÇİNDEKİLER

    SAYFA NO
GİRİŞ......................................................................................................... 1
GENELBİLGİLER........................................................................................2
GEREÇ VE YÖNTEM................................................................................14
BULGULAR...............................................................................................23
TARTIŞMA............................................................................................... 35
SONUÇ......................................................................................................44
ÖZET.........................................................................................................46
YABANCI DİL ÖZETİ.................................................................................48
KAYNAKLAR.............................................................................................50

		

TABLOLAR ÇİZELGESİ

   SAYFA NO

Tablo-I: Fakültatif, anaerobik, katalaz negatif, gram pozitif kokların fenotipik özellikleri........4
Tablo-II: Enterokok türlerinin identifikasyonu.........................................................................7
Tablo-III: Bu çalışmada besicilerden izole edilen enterokok sayı ve oranları......................24
Tablo-IV: Besicilerde rektal sürüntü örneklerinde ECA ve ECB besiyerlerinde
 enterokok izolasyon dağılımı..............................................................................................25
Tablo-V: Besicilerde dışkı örneklerinde ECA ve ECB 
besiyerlerinde enterokok izolasyon dağılımı ......................................................................25
Tablo-VI: Besicilerde rektal sürüntü ve dışkı örneklerinin  ECA besiyerlerinde
 enterokok izolasyon dağılımı..............................................................................................26
Tablo-VII: Besicilerde rektal sürüntü ve dışkı örneklerinin ECB 
besiyerlerinde enterokok izolasyon dağılımı......... ..............................................................26
Tablo-VIII: Besicilerde izole edilen enterokok türleri ve oranları .........................................27
Tablo-IX: Besicilerde izole edilen enterokokların antibiyotiklere direnç durumları...............28
Tablo-X: Sığırlardan izole edilen enterokok sayı ve oranları .................................. ...........30
Tablo-XI: Sığırlarda rektal sürüntü örneklerinde ECA ve ECB besiyerlerinde                    
enterokok izolasyon dağılımı   ............................................................................................30
Tablo-XII: Sığırlarda dışkı örneklerinde ECA ve ECB besiyerlerinde  
enterokok izolasyon dağılımı   ............................................................................................31
Tablo-XIII: Sığırlarda rektal sürüntü ve dışkı örneklerinin ECA 
besiyerlerinde enterokok izolasyon dağılımı ......................................................................31
Tablo-XIV: Sığırlarda rektal sürüntü ve dışkı örneklerinin ECB
 besiyerinde enterokok izolasyon dağılımı .........................................................................32
Tablo-XV: Sığırlarda izole edilen enterokok türleri ve oranları ...........................................33
Tablo-XVI: Sığırlarda izole edilen enterokokların antibiyotiklere direnç durumları..............34

ŞEKİLLER ÇİZELGESİ
                                                                               SAYFA NO
Şekil-1:.................................................................................................. ....18

GİRİŞ
Enterokokların toplumdan kazanılmış ve nozokomial infeksiyon nedeni olarak önemleri artmaktadır. Son yıllarda ABD‘de nozokomiyal infeksiyonlarda ikinci sıraya yükselmiş ve hastane kökenli bakteriyemilerde üçüncü sırada yer almaktadır (1-4). Daha önce Grup D streptokoklar içinde sınıflandırılan enterokoklar insan gastrointestinal ve safra yollarında, daha düşük olarak da vajen ve erkek üretrasının normal florasında bulunurlar. Diğer streptokokların çoğunlukla duyarlı olduğu antibiyotiklere dirençli olmaları insanda hastalık etkeni olarak önemlerini artırmaktadır. İnvitro incelemelerde enterokokların test edilmesi bunların diğer streptokoklara göre 10-100 kat penisilin MİC değerlerine sahip olduğunu göstermiştir (2-7).

Enterokokların çeşitli antibiyotiklere direncinin giderek artış göstermesi ve özellikle vankomisine dirençli enterokokların artışı  önemlerini artırmaktadır. Özellikle Avrupa’da çeşitli hayvan yemlerinde  büyüme faktörü olarak bir glikopeptid olan avoparsin kullanımı, vankomisine dirençli enterokok suşlarının hayvanlardan besin zinciri yoluyla insanlara yayılmasına yol açmıştır. Avoparsin kullanımının çeşitli Avrupa ülkelerinde yasaklanmasından sonra Van A tipi vankomisine dirençli enterokok suşlarının izolasyonda azalma saptandığı belirtilmektedir (4-6).

Bu çalışmada besicilerde (sığır yetiştiricilerinde) ve sığırlarda vankomisine dirençli enterokok suşlarının sıklığı araştırılmıştır. Dışkı ve rektal sürüntü örnekleri vankomisinli ve vankomisinsiz Enterococcosel Agar ve Enterococcosel Broth besiyerlerine ekilmiştir. İzole edilen enterokok suşlarının tür identifikasyonları biyokimyasal testler kullanılarak yapılmıştır. Ayrıca çeşitli antibiyotiklere duyarlılıkları, vankomisin ve teikoplanin duyarlılıkları test edilmiştir.

GENEL BİLGİLER

Enterokoklar başlangıçta enterik gram pozitif kok olarak sınıflandırılmış ve sonra Streptococcus genusu içine alınmışlardır. Lancefield serolojik tiplendirme sisteminin kuruluşu ile enterokoklar D grubu streptokoklar içinde sınıflandırılmışlardır (2-5). Daha sonra 1980’li yıllarda genetik farklılıklar temelinde enterokoklar streptokoklardan ayrılarak Enterococcus genusu olarak sınıflandırılmışlardır (4,5). 

Enterokoklar insan gastrointestinal, safra yolları ve daha düşük olarak da vajen ve erkek üretrasının normal florasında bulunurlar. Diğer streptokokların çoğunlukla duyarlı olduğu antibiyotiklere dirençli olmaları enterokokların önemlerini artırmaktadır (2,3,5).

Enterokoklar tekli veya çiftli kısa zincirler oluşturan gram pozitif koklardır. Katı besiyerlerinden hazırlanan preparatlarda Gram boyamada bazen kokobasil olarak görülebilirler. Enterokoklar fakültatif anaerobturlar, 10 0C ve 45 0C‘de üreyebilirler, optimum üreme ısıları 35 0C’dir. Tüm türler %6.5 NaCl de ürerler ve %40 safra tuzu varlığında eskülini hidrolize ederler. Bazı türlerinde hareket gözlenir. E.cecorum, E.columbae ve E.saccharolyticus dışındaki tüm türler pyrrolidonyl-β-napthylamide (PYR) hidrolizi yaparlar. Hepsi lösin aminopeptidaz (LAP) üretirler (2-6,8).

Enterokoklar sitokrom enzimleri içermedikleri için katalaz negatiftirler. Bazı türler psödokatalaz ürettikleri için zayıf katalaz pozitif reaksiyon verirler. Hemen hemen tüm türler homofermantatiftir, glukoz fermantasyonunun son ürünü laktik asittir ve gaz oluşturmazlar. Tüm türler hücre duvarı ile ilişkili gliserol teikoik asit antijeni yaparlar. Bu streptokokal grup D antijenidir. Grup D antijenin taranması güçtür. Ekstraksiyon işlemi ve kullanılan antiserumun kalitesi sonucu etkiler. DNA’nın G+C içeriği %37-45 mol dür (2-6).

Taksonomik analiz için genetik tekniklerin yaygın kullanılmasından önce enterokoklar 100C ve 450C‘de üreme ve %6.5 NaCl’de üreyebilmeleri, pH 9.6’da üremeleri, %40 safra varlığında eskülini hidrolize etmeleri, Lancefield grup D antijeni içermeleri ve PYR testi pozitifliği ile %90’nın üzerinde diğer streptokoklardan ayrılabilmektedir (2-7). 
Klinik izolatların %80-90’nında Enterococcus faecalis, %5-10’nunda Enterococcus faecium saptanır. Diğer enterokoklar E.casseliflavus, E.durans, E.gallinarum, E.raffinosus, E.hirae, E.malodoratus ve E.mundtii’dir. Diğer türler insan klinik örneklerinde nadiren bulunur yada primer olarak çeşitli hayvanların gastrointestinal sistemlerinde bulunur (2,3,7,8).
        
Enterokoklar genellikle virulan olmayan mikroorganizmalardır. Bazı çalışmalarda saptanan virulans faktörleri vardır. Sitolizin, agregasyon maddesi, feromonlar, lipoteikoik asit, proteaz, hiyalüronidaz, gelatinaz, AS-48, yüzey karbonhidratları bunlardandır (9-11).

GÖRÜNÜM VE BOYANMA ÖZELLİKLERİ

Sıvı besiyerlerinden hazırlanan Gram boyalı preparatlarda enterokoklar oval, tekli, ikili yada kısa zincirler yapmış gram pozitif koklar olarak görülürler. Katı besiyerlerinden hazırlanan preparatlarda ise kokobasil olarak görülürler (2-5). 

Diğer gram pozitif, katalaz negatif koklardan ayrımı tablo-I’de verilmiştir.

 Tablo-I: Fakültatif anaerobik, katalaz negatif, gram pozitif kokların fenotipik özellikleri (2)

GENUS	

MORFOLOJİ	
VAN	
GAZ	
PYR	
LAP	
BE	
NaCl	
10 0Cde ÜREME	
45 0Cde      ÜREME	
MOT	
HEM	
Enterococcus	zincir	S	-	+	+	+	+	+	+	D	, , n	
Streptococcus	zincir	S	-	-	+	-	-	-	D	-	, , n	
Globicetella	zincir	S	-	+	-	-	+	-	-	-		
Lactococcus	zincir	S	-	+	+	+	D	+	-	-	, n	
Vagococcus	zincir	S	-	+	+	+	+	+	-	+	, n	
Leuoconostoc	zincir	R	+	-	-	D	D	+	D	-	, n	
Pedicoccus	Küme,Tetrat	R	-	-	+	+	D	-	+	-		
Tetragenococcus	Küme,Tetrat	S	-	-	+	+	+	-	+	-		
Aerococcus	Küme,Tetrat	S	-	+	-	D	+	-	+	-		
Gemella	Küme,Tetrat	S	-	+	D	-	-	-	-	-	, n	
Helcococcus	Küme,Tetrat	S	-	+	-	+	+	-	-	-	n	
                 
VAN:Vankomisin (30 g disk) duyarlılığı, GAZ:Mann Rogosa, Sharpe(MRS) sıvı besiyerinde gaz oluşumu, PYR: L-pyrrolydonly--naphthylamide hidrolizi, LAP:Leucine aminopeptidase üretimi, BE:Safralı eskulin hidrolizi, NaCl:% 6.5 NaCl içeren besiyerinde üreme, HEM:%5 koyun kanlı besiyerinde hemoliz, :Alfa hemoliz, :Beta hemoliz, n:Nonhemolitik, S:duyarlı, R:Dirençli, -:> % 95 negatif reaksiyon, +:> % 95 pozitif reaksiyon, D:Değişken reaksiyon
ÜREME ÖZELLİKLERİ
Enterokoklar fakültatif anaerob mikroorganizmalardır. Optimal 35 0C ve pH 7.6’da iyi ürerler. Ancak çoğu türleri 10 0C ve 45 0C ‘de ve pH 9.6’da üreyebilirler. İzolasyon için kan ilave edilmiş uygun bir kanlı agar (triptik soy agar, brain heart infüzyon agar) kullanılabilir. Hemolizi göstermek için besiyerine %5 koyun kanı eklenir. İzolasyon için çeşitli besiyerleri kullanılabilir. E.faecalis’in hemoliz karakteri kullanılan kanın cinsine göre değişir. Koyun kanlı besiyerinde genellikle hemoliz oluşturmazlar. At yada tavşan kanı içeren besiyerlerinde bazı suşları hemoliz oluşturabilir (2-5).

Colombia colistin-nalidixic acid agar (CNA) ve phenylethyl alchol agar (PEA) gibi seçici besiyerleri enterokokların izolasyonunu sağlar (2-5).
Gram negatif bakterileri içeren örnekler için bile-esculin azide agar, selektif enterococcus agar, enterococcosel agar ve diğer azid içeren besiyerleri kullanılabilir. 35-37 0C de 18-24 saatlik inkubasyondan sonra kanlı agarda 0.5-1 mm çapında, keskin sınırlı, düzgün yüzeyli, gri-beyaz koloniler oluşur. Koloniler alfa, beta veya  nonhemolitik olabilir (3).
  İDENTİFİKASYON
Enterokokların identifikasyonları için çeşitli fizyolojik ve biyokimyasal testler kullanılır. Öncelikle mannitol, sorbitol, sorboz sıvı besiyerlerinde asit oluşturma ve arginin hidrolizine göre değerlendirilir. Bu özelliklerine göre 
Enterokoklar 4 grupta incelenebilir (3).
  Grup I: E.avium, E.malodoratus, E.raffinosus, E.psedoavium bu gruptadır.
Bunlar karbonhidratlardan asit oluşturur. Fakat arginini hidrolize etmezler.
  Grup II : E.faecalis, E.solitarius, E.faecium, E.casseliflavus, E.mundtii, E.flavescens ve E.gallinarum bulunur.
Bu grup üyeleri arginini hidrolize ederler ve mannitolden asit oluştururlar. Sorbozdan asit oluşturmazlar. Sorbitole etkileri değişkendir.
Grup III :E.durans, E.hirae, E.dispar ve E.faecalis varyantlarından oluşur. Arginini hidrolize ederler ama mannitol, sorbitol ve sorbozdan asit oluşturmazlar.
Grup IV : E.sulfureus bulunur. Arginini hidrolize etmez. Mannitol, sorbitol, sorbozdan asit oluşturmaz.
Her grup içindeki türlerde daha sonra spesifik reaksiyonlarla birbirinden ayrılır.
Grup I deki türler arabinoz ve rafinoz sıvı besiyerlerindeki reaksiyonlarına göre ayrılabilir. E.avium arabinozdan asit oluşturup rafinozu kullanmazken, E.malodoratus rafinozdan asit oluşturur ve arabinozu kullanmaz. E.rafffinosus her ikisinde de asit oluşturur. E.pseudoavium karbonhidratları kullanmaz.
     
       Grup II de sadece E.faecalis tellüriti tolere eder ve piruvatı kullanır. E.faecium ve E.gallinarum hareket testiyle birbirinden ayrılır. E.gallinarum hareketli, E.faecium hareketsizdir. E.flavescens ribozdan asit oluşturmaz. E.casseliflavus ise ribozu kullanır. E.casseliflavus, E.mundtii ve E.flavescens sarı pigment oluşturur.
   
      Grup III üyeleri piruvat, rafinoz, ve sukroz testleri ile kolayca ayrılabilirler. E.durans’ta tümü negatiftir. E.dispar’da tümü pozitiftir. E.hirae için biri veya her ikisi pozitif ve piruvat negatiftir. E.faecalis varyantlarında piruvat pozitiftir, rafinoz ve sukrozdan asit oluşturmazlar (3).
Grup I,II,III ve IV de yer alan enterokoklar ve ayırıcı özellikleri tablo –II’de gösterilmiştir (2,3).
 Enterokoklar toprakta, suda, gıdalarda, hayvanlarda, kuşlarda ve böceklerde doğal olarak bulunurlar. İnsanlarda özellikle gastrointestinal sistem ve genitoüriner sistemde yerleşirler. İnsan dışkısından elde edilen enterokok türleri coğrafi ve beslenmeye bağlı değişiklikler gösterirler. İnsandaki diğer yerleşimleri oral kavite, hepatobiliyer sistem, yumuşak doku lezyonları ve kronik dekübit ülserleridir (2-5). 
                            Tablo-II: Enterokok türlerinin identifikasyonu (3)

Türler	mannitol	sorbitol	sorboz	arginin	arabinoz	rafinoz	tellürit	hareket	pigment	sukroz	piruvat	riboz	
Grup I													
E.avium	+	+	+	-	+	-	-	-	-	+	+	+	
E.malodoratus	+	+	+	-	-	+	-	-	-	+	+	+	
E.raffinosus	+	+	+	-	+	+	-	-	-	+	+	+	
E.pseudoavium	+	+	+	-		-	-	-	-	+	+	+	
Grup II													
E.faecalis	+	+	-	+	-	-	+	-	-	+	+	-	
E.faecium	+	-	-	+	+	-	-	-	-	+	-	+	
E.casseliflavus	+	-	-	+	+	+	-	+	+	+	-	+	
E.mundtii	+	-	-	+	+	+	-	-	+	+	-	+	
E.flavescens	+	-	-	+	+	+	-	+	+	+	-	-	
E.gallinarum	+	-	-	+	+	+	-	+	-	+	-	+	
Grup III													
E.durans	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	?	
E.hirae	-	-	-	+	-	+	-	-	-	+	-	?	
E.dispar	-	-	-	+	-	+	-	-	-	+	+	?	
E.faecalis(var.)	-	-	-	+	-	-	+	-	-	-	+	?	
Grup IV													
E.sulfureus	-	-	-	-	-	+	-	-	+	+	-	+	

+: >%90 pozitif reaksiyon.  -: > %90 negatif reaksiyon.  ?:Bilinmeyen reaksiyon
 
 Üriner sistem infeksiyonları, insanlarda en sık görülen enterokokal
infeksiyonlardır. Bu infeksiyonların büyük kısmı hastane kaynaklıdır. Üriner sistemin yapısal anomalileri, kateterizasyon ve özellikle sefalosporinler olmak üzere önceki antibiyotik kullanımı infeksiyon gelişiminde önemli rol oynar. Hastanede sefalosporin kullanımının artmasına paralel olarak enterokokal üriner sistem infeksiyonlarında artış olduğu belirtilmektedir. Enterokoklar üriner sistem infeksiyonlarının %10’undan, hastane kaynaklı üriner sistem infeksiyonlarının ise %16’sından sorumludurlar (3).

       Enterokokların ikinci sıklıkta izole edildiği bölgeler intraabdominal veya pelvik yara infeksiyonlarıdır. Bu infeksiyonlar genellikle polimikrobiyaldir. Enterokoklar genellikle bağırsakta normalde bulunan diğer fakültatif ve anaerobik bakterilerle birlikte bulunur ve bu infeksiyonların patogenezindeki rolleri tartışmalıdır. Bazen enterokoklar intraabdominal infeksiyonlarda tek etken olabilirler. Enterokoklar intraabdominal infeksiyonların %10-25’inden izole edilmektedir. Diyaliz kateteri gibi yabancı cisimlerin varlığı intraabdominal enterokokal infeksiyonlar için bir risk faktörüdür (3).
Artmış antibiyotik kullanımı ve direnç gelişimi nedeniyle enterokoklar yara infeksiyonlarından artan bir sıklıkta izole edilmektedir. Safradan elde edilen mikroorganizmalar arasında E.coli’den sonra ikinci sırada gelmektedir (3).
       
     Üçüncü sıklıkta görülen enterokokal infeksiyon tipi bakteriyemidir.
Hastane kaynaklı bakteriyemilerin %7.1’i enterokoklara bağlıdır. Daha çok altta yatan ciddi problemleri olan yaşlı hastalarda ve hastanede uzun süre yatan ve antibiyotik kullanan immün sistemi baskılanmış kişilerde görülür.            Son yıllarda yapılan çalışmalar enterokokal bakteriyemi insidansında artış olduğunu göstermiştir. E.faecalis, polimikrobiyal bakteriyemilerden en sık izole edilen gram pozitif mikroorganizmadır. Enterokokal bakteriyemi genitoüriner, gastrointestinal ve hepatobiliyer sistemlerin kolonizasyon veya vasküler yetmezlik gibi yumuşak doku hasarı üzerinde ortaya çıkan
infeksiyonlardan da izole edilebilmektedir (3,5).
      
      Enterokokal infeksiyonların genellikle endojen kaynaklı olduğu düşünülmektedir. Son yıllarda yapılan çalışmalar özellikle dirençli enterokok türlerinin hastadan hastaya veya kolonize hastane personeli tarafından hastalara bulaştırılabileceğini göstermiştir (5). Ayrıca yapılan çeşitli çalışmalarda insan ve hayvan orijinli VRE izolatları arasında genetik geçiş olabileceği belirtilmektedir (12-14).

Bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda ve hastanede uzun süre yatanlarda, özellikle yoğun bakım ünitelerinde yatan hastalarda ve daha önceden antibiyotik kullanımı olanlarda enterokok infeksiyonlarına eğilim artmaktadır. Enterokoklar nozokomiyal infeksiyonların sorumlusu olarak 3. sırada yer almaktadır (15).

      Enterokoklar, birçok antimikrobiyal ajana dirençli olmaları nedeniyle
hastane ortamında kolaylıkla üreyebilmektedir. Dirençli suşlara bağlı
kolonizasyon ve infeksiyon görülme olasılığı giderek artmaktadır. Doğal
direncin yanısıra çeşitli antibiyotiklere karşı kazanılmış direncin ortaya çıkması önemli bir problem oluşturmaktadır (2, 3,15,16 ,17).

 Enterokoklar  düşük afiniteli penisilin bağlayıcı proteinler (PBP) ürettikleri için, beta-laktam antibiyotiklere karşı doğal dirence sahiptir. E.faecium’un ürettiği PBP’lerin birçok sefalosporine olan afinitesi olağanüstü ölçüde düşüktür; bu da, söz konusu ajan grubun enterokoklara karşı aktivitesinin zayıf olduğunu ifade etmektedir (2,3,5,18).

        Enterokoklar, birçok antibiyotik grubuna karşı yüksek düzeyde direnç kazanmıştır. Enterokoklar antibiyotiklere doğal ya da kazanılmış direnç gösterebilirler (2-5,15).

        Doğal direnç aminoglikozidlere (düşük düzeyde) ve özellikle penisilinaza dirençli penisilinler ve sefalosporinler olmak üzere beta-laktam antibiyotiklere karşı saptanırken, kazanılmış direnç aminoglikozidlere (yüksek düzeyde), kloramfenikol, florokinolonlar gibi çeşitli antibiyotiklere karşı gelişebilir. Bu tür direnç çoğunlukla plazmid ve transpozonlarla aktarılmaktadır (15).

        Beta-laktam antibiyotikler için doğal direnç nedeni protein bağlayan proteinlerdeki (PBP) düşük afinitedir (özellikle PBP 5). Hücre duvarına etkili antibiyotiklere karşı gelişen kazanılmış direncin önemli bir şekli toleranstır. Beta-laktam antibiyotiklere gerek doğal dirençli gerekse toleran enterokoklarla oluşan infeksiyonlarda bu antibiyotiklerin aminoglikozidlerle kombine kullanımı standart tedavi şemasını oluşturur. Beta-laktamlara karşı dirençte bir diğer mekanizma 1980’lerden itibaren giderek artan beta-laktamaz üretimidir. Bu nedenle klinik laboratuvarlarda enterokok izolatlarının beta-laktamaz üretimi araştırılmalıdır (5,6,15).

        Aminoglikozid antibiyotiklere karşı doğal direnç düşük düzeyde olup antibiyotiklerin hücre içi penatrasyonundaki yetersizlik sonucu gözlenir. Bu direnç aminoglikozidler hücre duvarına etkili bir ajanla birlikte kullanıldığında aşılabilir (2,3,5,15,19).

Yüksek düzeyde aminoglikozid direnci ya ribozomal mutasyon (sadece streptomisin için) ya da plazmidle aktarılan aminoglikozid modifiye edici enzimlere bağlı olarak ortaya çıkar. Bu tür dirençte beta-laktam antibiyotiklerle sinerjistik etkileşim söz konusu değildir (5,15,19).

Yüksek düzeyde aminoglikozid direnci tüm dünyada artan bir yayılım göstermektedir. Bu nedenle özellikle endokardit ve menenjit gibi ciddi olgularda izole edilen enterokoklar yüksek düzey aminoglikozid direnci açısından taranmalıdır (2,3,15,19). Vankomisine dirençli enterokoklar (VRE) 1980’li yılların sonlarından itibaren  tanımlanmaya başlanmıştır (3-5,15).

Glikopeptidler hücre duvarı sentezini inhibitörüdürler. beta-laktamlarla karşılaştırıldığında glikopeptidler hücre duvarı biyosentez enzimlerini etkilemezler. Bunlar büyük, rijit ve hidrofobik moleküllerdir ve hücre yüzeyinde peptidoglikan prekürsörlerinin D-alanyl-D-alanine (D-ala-D-ala) terminalleri ile kompleksler oluştururlar. Sitoplazmik membranın yüzeyinde bu büyük komplekslerin varlığı; interpeptidik bağların oluşumunun engellenmesi ve büyümüş peptidoglikan dallanmayla sitoplazmik prekürsörlerin transferinin engellenmesi ile hücre duvarı sentezini engeller (4-6).

Glikopeptidlere direnç modifiye prekürsörlerin sentezi yüzündendir ki bu prekürsörler teikoplanin ve vankomisine azalmış afinite gösterir. Bu modifikasyon yani peptidoglikan biyosentez yolunun değişmesi peptidoglikan sentezi için bir alternatif yol oluşturur. Bu değişiklik eşzamanlı enzimatik sistemi kodlayan bir gen demetinin bakteriyel kazanımıdır.

Glikopeptidlere dirençli enterokoklarda D-Ala-D-Ala dipeptidinin yerini, glikopeptidlere afinitesi azalmış olan, dolayısıyla da glikopeptidlerin varlığında hücre duvarı sentezinin devam etmesini sağlayan  D-Ala-D-Lac depsipeptidi alır. Van C fenotipinde ise D-Ala-D-serin dipeptidi alır. Van A fenotipinin ekspresyonu için gerekli bütün bilgiler, ilk olarak E.faeciumda saptanan Tn1546 transpozonu üzerinde taşınır (4).

Enterokoklarda Glikopeptidlere direnç 5 tipte olabilir.Van A, Van B, Van C, Van D ve Van E olarak adlandırılır (2-5).

1)Van A glikopeptid direnci: Hem vankomisine hem teikoplanine direnç vardır. Vankomisin direnci yüksek düzeyde ve indüklenebilir bir dirençtir. Teikoplanine direnç düşük düzeyde ve indüklenebilir bir dirençtir. En sık E.faeciumda, daha az E.faecalis’te saptanır. 

2) Van B glikopeptid direnci: Yalnızca vankomisine karşı düşük yada yüksek düzeyde direnç vardır. Teikoplanine direnç yoktur. İndüklenebilir bir dirençtir. E.faecium ve E.faecalis’te sık görülür. Diğer enterokok türlerinde de görülebilir. S.bovis’te de gösterilmiştir.

3) Van C glikopeptid direnci: Bu tip direnç E.gallinarum, E.casseliflavus ve E.flavescens’te görülür. Transfer edilemeyen ve indüklenemeyen bir dirençtir. Düşük derece vankomisine direnç vardır. Teikoplanine direnç yoktur.

4) Van D glikopeptid direnci: Vankomisine düşük düzeyde direnç teikoplanine düşük derece direnç vardır veya duyarlıdır. Kromozomda lokalizedir ve transfer edilemez.

5) Van E glikopeptid direnci: Van E direnç geni son zamanlarda E.faecalis BM4405’te tanımlanmıştır. Vankomisine düşük derece dirençli ve teikoplanine duyarlıdır. Fenotipi doğal Van C tipi rezistansa benzerlik gösterir (4).
      
       Enterokoklardaki Van A ve Van B direnç genleri diğer enterokok türleri arasında aktarılabildiği gibi, A grubu ve viridans grubu streptokoklara, Listeria monocytogenes’e ve Staphilococcus aureus’a aktarılabilmiştir. S.aureus’a direnç genlerinin transferi sonucunda yüksek düzeyde vankomisin direnci gelişmiştir. Bu invitro olarak ve fare derisinde deneysel olarak gösterilmiştir. Vankomisin direnç genleri nonenterokokal insan izolatlarında bulunmuştur (2-5).

Vankomisin bağımlı enterokoklar: Üremeleri İçin vankomisine gereksinim duyarlar (4).

Özellikle Avrupa’da et üretimini artırmak amacıyla büyütme faktörü olarak glikopeptid bir antibiyotik olan avoparsin yoğun olarak kullanılmıştır. Avoparsin kullanımı VRE suşlarının hayvanlardan insanlara geçişine yolaçmıştır. İlk olarak 1995’te Danimarka’da enterokoklarda avoparsin ve vankomisine direnci kodlayan genin hayvanlarda gösterilmesi üzerine avoparsin bu ülkede yasaklanmıştır. Daha sonra değişik ülkelerde de yasaklanmıştır. En son Avrupa topluluğu nisan 1997’de avoparsinin bir büyütme faktörü olarak hayvanlarda kullanımını yasaklamıştır. Çeşitli Avrupa ülkelerinde yapılan çalışmalarda avoparsin kullanımının yasaklanmasından sonra VRE suşlarında büyük bir azalma saptanmıştır (17,20).

Avoparsinin 1995 yılında yasaklandığı Danimarka’da, belki de hastanelerde vankomisinin sınırlı kullanımının da katkısıyla glikopeptidlere dirençli E.faecalis oranında azalma gözlendiği belirtilmektedir. Kanatlı kesimhanelerinde ve insanda 1995’de direnç sıklığı %12 civarında iken 1997’de bunun %3.3’e düştüğü belirtilmektedir (20).

Ülkemizde ise avoparsinin ithali ve kullanımı 30 Haziran 1999 tarihinde Tarım ve Köyişleri Bakanlığının bir tebliği ile yasaklanmıştır (21).

GEREÇ VE YÖNTEM
ÇALIŞMA GRUBU
 Bu çalışmada Denizli ve çevresindeki besicilerde (sığır yetiştiricilerinde) ve besi hayvanlarında (sığırlarda) VRE kolonizasyonu araştırılmış, bu amaçla dışkı ve rektal sürüntü örnekleri alınmıştır. Çalışma kişilere anlatılmış ve onayları alınmıştır. Örnek alımı sırasında kişilerin yaşı, cinsiyeti, herhangi bir antibiyotik kullanıp kullanmadığı ve altta yatan bir hastalık olup olmadığı (diabetes mellitus, malignite, immün yetmezlik) belirlenmiştir.
ÖRNEKLERİN ALINMASI VE EKİLMESİ
Dışkı örnekleri kuru ve temiz dışkı toplama kaplarına alınmıştır. Steril pamuklu eküvyonlarla alınan rektal sürüntü örnekleri 3 ml fosfat tamponlu su (PBS) içine konulmuştur. Alınan tüm örnekler 2 saat içinde laboratuvara getirilmiştir ve ekimleri yapılmıştır. 

Alınan dışkı örnekleri tartılmış ve 1/10 oranında sulandırılmıştır (0.5 gr.dışkı 4.5 ml. serum fizyolojik) ve bu süspansiyondan 1’er ml.si (6 g/ml vankomisin içeren ve içermeyen) iki ayrı  Enterococcosel broth (ECB) besiyerine ekilmiştir. Ayrıca 0.01ml.si de iki ayrı (6 g/ml. Vankomisin içeren ve içermeyen) Enterococcosel agar (ECA) besiyerine ekilmiştir.  ECB besiyerinde 48 saat inkübasyondan sonra üreme olanlar ECA besiyerine subkültüre edilmiştir.

Rektal sürüntü örnekleri de vankomisinli (6 g/ml) ve vankomisinsiz ECA  besiyerlerine ekilmiş ve daha sonra iki ayrı ECB (6 g/ml vankomisin içeren ve içermeyen) besiyerinde 48 saat inkübasyondan sonra üreme olanlar ECA besiyerine subkültüre edilmiştir.
Serum Fizyolojik Solüsyonu (%0.9)(SF)
NaCl                                 9 g
Distile su                          1.0 L
        Dışkı örnekleri SF ile 1/10 oranında sulandırılmıştır.
Phosphate Buffered Saline (PBS)
Anhydrous Na2HPO4        12.0 g
NaH2PO4.H2O                   2.2 g
NaCl                                  85.0 g
Maddeler 1000 ml distile suda eritilmiş ve pH 7.4’e ayarlanarak 121 0C’de 15 dakika otoklavda sterilize edillmiştir. Steril tüplere dağıtılmıştır.
Enterococcosel Agar(ECA)
Pancreatic digest of casein                     17  g
Peptic digest of animal tissue                  3   g
Yeast extract                                            5   g
Oxgall                                                     10   g
NaCl                                                         5   g
Sodyum sitrat                                           1   g
Esculin                                                     1   g
Ferrik Amonyum Sitrat                          0.5   g
Sodyum Azid                                      0.25   g
Agar  	              19   g
Distile Su                                          1000   ml

Besiyerini hazırlamak için ticari olarak hazırlanan preparasyondan 62 g alınmış ve 1000 ml. distile suda çözündürülmüş, pH 7.1’e ayarlanmıştır. Otoklavda 121 0C de 15 dakika sterilize edilerek vankomisinli besiyeri için 6 g/ml vankomisin ilave edilmiş ve steril  petri kutularına  dökülmüştür. Herbir örnek hem vankomisinli  hem de vankomisinsiz ECA besiyerine ekilmiştir.
Enterococcosel Broth(ECB)
Pancreatic digest of casein                     17   g
Peptic digest of Animal tissue                   3   g
Yeast extract                                             5   g
Oxgall                                                      10   g
NaCl                                                         5    g
Sodyum sitrat                                          1     g
Esculin                                                    1     g
Ferrik Amonyum Sitrat                           0.5  g
Sodyum Azid                                        0.25  g
Distile Su                                            1000 ml

Besiyerini hazırlamak için ticari olarak hazırlanan preparasyondan 43 g alınmış ve 1000 ml. distile suda çözündürülmüş, pH 7.1’e ayarlanmıştır. Otoklavda 121 0C de 15 dakika sterilize edilmiştir. Vankomisinli besiyeri için 6g/ml vankomisin ilave edilmiş ve steril  tüplere dökülmüştür. Herbir örnek hem vankomisinli  hem de vankomisinsiz ECB besiyerine ekilmiştir. ECB besiyerinde kahverengi-siyah renk değimi pozitif kabul edilmiş ve ECA besiyerine subkültüre edilmiştir.

İZOLASYON VE İDENTİFİKASYON
Ekim yapılan plaklar (direkt ECA besiyerine ekilen ve ECB’da 48 saatlik inkubasyondan sonra ECA’ya ekim yapılan) 37 0C de 24 saat inkübe edildikten sonra enterokok kolonisi yönünden değerlendirilmiştir. ECA besiyerindeki siyah-koyu kahve renkli kolonilerin katalaz aktivitesi kontrol edilmiştir. Öze ile lama alınan koloni üzerine %3 hidrojen peroksit damlatılarak hava kabarcığı oluşumu incelenmiştir. Katalaz negatif ve entorokok şüpheli siyah-kahverengi kolonilere Gram boyama yapılarak morfolojileri incelenmiştir. Tek tek veya çiftler halinde, zincirler oluşturan gram pozitif kok görüntüsü veren kolonilerin enterokok olabileceği düşünülerek safralı eskülini hidroliz etme ve %6.5 NaCl ile tuz tolerans testi yapılmıştır. Safralı eskülini hidrolize eden ve %6.5 NaCl içeren besiyerinde üreyen kolonilerden %5 koyun kanlı agara pasajları yapılmıştır. Bu kolonilerin hemolizleri incelenmiş, PYR testi yapılmış ve pozitif olanlar enterokok olarak kabul edilmiştir. 

     İzole edilen suşların tür identifikasyonu için arginin dihidrolaz aktivitesi, mannitol, sorboz, sukroz, rafinoz, laktoz, arabinoz ve sorbitolden asit oluşturmaları, piruvat kullanımı, hareketleri  ve pigment oluşumları incelenmiştir. Tür identifikasyonları şekil-1’deki akış şemasına göre yapılmıştır. Disk difüzyon yöntemi ile vankomisin ve teikoplanin de dahil 10 antibiyotiğe duyarlılıkları ve beta – laktamaz  üretimleri incelenmiştir. 
Safralı Eskulin Hidroliz Deneyi
Bile Esculin Agar
Beef extract                                            3.0  g
Peptone                                                  5.0  g
Esculin                                                    1.0  g
Oxgall                                                    40.0  g
Ferric citrate                                           0.5  g
Agar                                                      15.0  g
Distile su                                             1000 ml

Preparasyonun 65 gramı 1000 ml. distile suda eritilmiş ve otoklavda 121 0C de 15 dakika sterilize edilmiştir (pH:6.6). Eskülin hidrolizi sonucu eskülitin ve glukoz oluşur. Eskülitin de ferrik iyonlarla siyah kompleks şekil oluşturur. 
ECA besiyerinde üreyen gram pozitif kok şeklinde morfolojiye sahip, katalaz negatif bakteri kolonilerinden besiyerine ekim yapılmış ve 24 saat 35 0C’de inkubasyondan sonra besiyerini siyahlaştıran üreme pozitif olarak kabul edilmiştir.

                                                             
                                                                            ENTEROCOCCUS SPP.
(%6.5 NaCl +,safralı eskülin +, PYR+)

                  					        Mannitol

                                        +                                                                                        -
	       
                           Arginin dihidrolaz/sorboz                                                                           Grup III
	            		               					              Sukroz/rafinoz
                      -/+                               +/-	
                       			                                                                                       
                          Grup I           		Grup II	                                                      +/+	                              -/-

                    Arabinoz/rafinoz                                                                                         
                  +/+=E.raffinosus                                                                                   		    		  
                  +/- =E.avium(H2S+)                                                                              	Piruvatta üreme      Piruvatta üreme    
                  -/+= E.malodoratus(H2S+)                                                          
                  -/- = E.pseudoavium                                                                         
                                                              Hareket                                                       
                                								
									        E.dispar    E.hirae       E.faecalis      E.durans

                                   +	-
                     	      Sarı pigment                                       Arabinoz    

                                                                                                                  	
                   +                                                	   +	-

   	 E.casseliflavus 	     E.gallinarum        Sarı pigment                     		  Laktoz

	

                                                        E.mundtii                               E.faecium            E.faecalis               Sukroz/melozitoz

                                                                                                                                              

                                                                                                                                            E.solitarius                    E.serolicida
                                      
                                               Şekil-1: Enterokok türlerinin ayırıcı özellikleri (2)     
Tuz Tolerans Testi
%6.5 NaCl içeren Besiyeri
Et özeti                                              3 g
Pepton                                             10 g
NaCl                                                65 g
Agar                                                15 g
Distile su                                    1000 ml
 
Hazırlanan eriyik pH 7.4 olarak ayarlanmış ve otoklavda 121 0C de 15 dakika sterillenmiştir. Tüplere dökülmüştür. İncelenen suşlar besiyerine ekilmiş ve 24-48 saat 37 0C de inkube edilmiştir. Üreme olanlar pozitif kabul edilmiştir.
Pyrrolidonyl-beta-Naphthylamide (PYR) Hidrolizi Testi
L-Pyrrolidonyl- β -Naphthalamide  (Sigma P5891)	
Ethanol (95%)	

Whatman No:3 süzgeç kağıtları 5x40mm. boyutlarında şeritler halinde kesilmiştir. Etanol içinde  L-Pyrrolidonyl-β-Naphthalamide’nin  %0.2’lik eriyiği hazırlanmıştır. Süzgeç kağıtları bu eriyiğe daldırılmış ve oda ısısında kurutulmuştur.
PYR ayıracı
N,N dimethylamino cinnamaldehyde   
İncelenen bakteri kağıt şeritlerin üzerine sürülerek yayılmış ve 5 dakika sonra PYR Ayıracı damlatılmıştır. iki dakika içinde kırmızı renk oluşumu PYR pozitif olarak kabul edilmiştir.

ENTEROKOKLARIN TÜR İDENTİFİKASYONU
Karbonhidrat Fermantasyon Testi
Beyin –kalp infüzyon buyyonu                   900 ml
Saf sudaki %10 karbonhidrat eriyiği          100 ml
Bromkresolmavisi(%1.6’lık eriyiğinden)         1 ml

Distile su içinde incelenecek karbonhidrat dışındakiler eritilmiştir. Otoklavda 121 0C’de 15 dakika sterillenmiş, daha sonra karbonhidrat eriyikleri (mannitol, sorboz, sukroz, rafinoz, laktoz, arabinoz, sorbitol) steril membran filtrelerle sterillenerek ilave edilmiş, pH 7.4’e ayarlanarak 12x75mm’lik steril tüplere 3’er ml dağıtılmıştır.

İncelenen kolonilerden 1-2 tanesi bu besiyerlerine ekilmiş ve 7 gün boyunca sonuçlar değerlendirilmiştir. Besiyerinin normalde mavi-yeşil olan renginin sarıya dönüşümü pozitif olarak kabul edilmiştir. Besiyeri renginin aynı kalması negatif olarak değerlendirilmiştir (2,3,22).
Piruvat kullanımı
Beyin –kalp infüzyon buyyonu                 900 ml
Saf sudaki %10 pruvik asit eriyiği            100 ml
Bromkresol mavisi  (%1.6 lık eriyiğinden)   1 ml 

Piruvat dışında eriyik 121 0C de 15 dakika sterillenmiştir. Daha sonra piruvat eriyiği steril membran filtre ile sterillenerek eklenmiştir. PH 7.4’e ayarlanmış ve12x75mm’lik steril  tüplere 3’ er ml dağıtılmıştır.
İncelenen kolonilerden 1-2 tanesi bu besiyerine ekilmiş ve 7 gün boyunca izlenmiş ve sonuçlar değerlendirilmiştir. Besiyerinin normalde mavi-yeşil olan renginin sarıya dönüşümü pozitif olarak kabul edilmiştir. Besiyeri renginin aynı kalması negatif olarak değerlendirilmiştir.

Motilite Araştırılması
Sığır eti özeti                                3  g 
Pepton                                        10  g
NaCl                                             5  g
Agar                                             4  g
Distile su                               1000 ml 

Hazırlanan eriyik 12x75mm’lik tüplere 5’er ml dağıtılmış ve 121 0C de 15 dk sterillenmiş ve pH 7.1’e ayarlanmıştır. Bakterilerin 24 saatlik saf kültüründen iğne öze ile dik ekim yapılmıştır. Yayılması ve bulanıklık oluşması pozitif olarak kabul edilmiştir.

Arginin Kullanımı
Moeller besiyeri
Peptone                                          5.0        g
Meat Extract                                   5.0        g
Bromcresol Purple (1.6%)              0.625  ml
Cresol Red (0.2%)                         2.5       ml
Glucose                                         0.5         g
Pyridoxal                                       5.0         g
Arginin                                           10         g
Distile su                                    1000       ml
Besiyeri içeriği kaynar su banyosunda eritilmiştir. Tüplere dağıtılıp 121 0C de 15 dakika sterillenmiştir. İncelenen bakteriler arginin içeren ve içermeyen besiyerlerine ekilmiştir. Tüplerin üzerleri 2 ml mineral yağ örtülüp, 35 0C’de inkube edilmiştir.
Pigment yapımının araştırılması
Pigment yapımı %5 koyun kanlı Müller-Hinton agar kullanılarak yapılmıştır ve 35 0C de 24-48 saatte sarı renk koloni oluşumu pozitif olarak kabul edilmiştir.
ANTİBİYOTİK DUYARLILIK TESTLERİ
İzole edilen enterokokların antibiyotik duyarlılıkları Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemiyle araştırılmıştır.  Vankomisin (30g), teikoplanin (30g), penisilin (10IU), ampisilin (10g), yüksek düzey gentamisin (120g), yüksek düzey streptomisin (300g), siprofloksasin (5g), sefaklor (30g), sefalotin (30g) ve tetrasiklin (30g) duyarlılıkları incelenmiştir. 
DİSK DİFFÜZVON YÖNTEMİ     
Diske emdirilen antibiyotiğin, duyarlılığı araştırılan organizmanın inoküle edildiği besiyerine diffüze olması temeline dayanan Kirby-Bauer yöntemi kullanılmıştır. Enterococcosel agar besiyerinde üremiş olan enterokoklar, kanlı agar plaklarına pasajlanmış ve 24 saatlik taze kültürler elde edilmiştir. Kanlı agar yüzeyindeki kolonilerden beyin kalp İnfüzyon broth içine ekim yapılmış, 37°C’lik etüvde inkube edilerek 0.5 Mc Farland bulanıklığına ulaşması sağlanmıştır. Bulanıklık ayarlandıktan sonra süspansiyon içine steril pamuklu eküvyon batırılıp tüpün kenarında eküvyon sıkılarak fazla sıvı bırakılmıştır. Eküvyon, Mueller-Hinton agar yüzeyine birbiri ile 60°’lik açı yapacak şekilde üç yönde sürtülerek. 15 dakika içinde antibiyotik diskleri yerleştirilmiş ve 37°C’de 18-24 saatlik inkubasyondan sonra inhibisyon zon çapları ölçülmüştür. (22,23).

BULGULAR

 Denizli ve çevresinde 111 besiciden ve 72 besi hayvanından (sığır) alınan  rektal sürüntü ve dışkı örneği incelenmiştir. 
Besici örnekleri 68 erkek ve 43 kadından alınmıştır. Antibiyotik kullanım öyküsü ve altta yatan bir hastalığı olanlar çalışmaya alınmamıştır.
Bu çalışmada alınan her rektal sürüntü ve dışkı örneği ECA ve ECB besiyerlerine ekilmiştir. Ayrıca VRE izolasyonunu kolaylaştırmak için 6g/ml vankomisin içeren ECA ve ECB besiyerlerine de ekilmiştir. ECB’a ekilen örnekler 48 saat inkubasyondan sonra ECA’ya pasajlanmıştır.
   
       ECA besiyerinde üreyen bakterilerden Gram boyama, eskülin hidrolizi, %6.5 NaCl besiyerinde üreme ve PYR testi ile enterokok olarak tanımlanan suşlar izole edilmiştir.
    
        Bu çalışmada 111 besiciden 96’sında (%86.4) enterok türleri izole edilmiştir. Vankomisin ve teikoplanine dirençli enterokok türü izole edilmemiştir. Bu çalışmada besicilerde izole edilen enterokok sayı ve oranları Tablo-III’de gösterilmiştir.
              
         Direkt ECA besiyerine ekilen rektal sürüntü örneklerinde 111 besicinin 61’inde (%54.9) enterokok izole edilmiştir. ECB besiyerinde 48 saatlik inkubasyondan sonra ECA besiyerine ekilen örneklerde 80’inde (%72.1) enterokok izole edilmiştir. İkisi arasındaki fark istatistiksel olarak çok anlamlı bulunmuştur (χ2 McNemar =12.000, SD=1, p=0.001)(Tablo-IV).
            
              Aynı rektal sürüntü örneklerinin ekildiği 6g/ml vankomisin içeren ECA besiyerinde ise 18’inden (%16.2) enterokok izole edilmiştir. Vankomisinli(6g/ml) Enterococcosel broth içinde (ECB-VA) 48 saatlik inkubasyondan sonra ekilen örneklerde ise 57’sinde (%51.3) enterokok izole edilmiştir.
 Direkt ECA besiyerine ekilen dışkı örneklerinde 62’sinde (%55.8) enterokok izole edilmiştir.
 
ECA besiyerinde enterokok izolasyonu açısından rektal sürüntü ve dışkı örnekleri arasında istatistiksel olarak fark bulunmamıştır (p>0.5)(Tablo-VI).

 ECB besiyerinde inkübe edildikten sonra ekilen dışkı örneklerinin 80’ninde (%72.1) enterokok izole edilmiştir. Dışkı örneklerinde de enterokok izolasyonu açısından ECA ve ECB besiyerleri arasında istatistiksel olarak çok anlamlı fark bulunmuştur (χ2 McNemar=10.321 , SD=1, p=0.001) (tablo:V).
      Vankomisin (6g/ml) içeren Enterococcosel Agar (ECA-VA) besiyerine ekilen dışkı örneklerinde ise 22’sinde (%19.8), vankomisin içeren (6g/ml) Enterococcosel broth (ECB-VA) besiyerinde 48 saat inkube edildikten sonra ekilen dışkı örneklerinde ise 55’inde (%49.5) enterokok izole edilmiştir.
 
 Tablo-III: Bu çalışmada besicilerde izole edilen enterokok sayı ve oranları :                      
	kullanılan besiyeri	Sayı	%	
Rektal sürüntü	ECA
ECA-VA
ECB
ECB-VA	61
18
80
57	54.9
16.2
72.1
51.3	
Dışkı	ECA
ECA-VA
ECB
ECB-VA	62
22
80
55	55.8
19.8
72.1
49.5	
	Toplam	96	86.4	

Tablo-IV: Besicilerde rektal sürüntü örneklerinde ECA ve ECB besiyerlerinde enterokok izolasyonu dağılımı

ECA	ECB	
TOPLAM	
	+	-		
+
-
TOPLAM	57
23
80	4
27
31	61
50
111	

Rektal sürüntü örneklerinde enterokok izolasyonu açısından ECA ve ECB besiyerleri arasında istatistiksel olarak çok anlamlı fark vardır 
(χ2 McNemar=12.000, SD=1, p=0.001) (Tablo-IV).

Tablo-V: Besicilerde dışkı örneklerinde ECA ve ECB besiyerlerinde enterokok izolasyonu dağılımı

ECA	ECB	
TOPLAM	
	+	-		
+
-
TOPLAM	57
23
80	5
26
31	62
49
111	
 
Dışkı örneklerinde enterokok izolasyonu açısından ECA ve ECB besiyerleri arasında istatistiksel olarak çok anlamlı fark vardır 
(χ2 McNemar=10.321 , SD=1, p=0.001).

Tablo-VI: Besicilerde rektal sürüntü ve dışkı örneklerinin ECA besiyerlerinde enterokok izolasyon dağılımı
Rektal sürüntü ECA	Dışkı ECA	
TOPLAM	
	+	-		
+
-
TOPLAM	44
18
62	17
32
49	61
50
111	

ECA besiyerinde enterokok izolasyonu açısından rektal sürüntü ve dışkı örnekleri arasında istatistiksel olarak fark bulunmamıştır (p>0.5).

Tablo-VII: Besicilerde rektal sürüntü ve dışkı örneklerinin ECB besiyerlerinde enterokok izolasyon dağılımı

Rektal sürüntü ECB	Dışkı ECB	
TOPLAM	
	+	-		
+
-
TOPLAM	66
14
80	14
17
31	80
31
111	
ECB besiyerinde enterokok izolasyonu açısından rektal sürüntü ve dışkı örnekleri arasında istatistiksel olarak fark bulunmamıştır (p>0.5).
       
        Besicilerden izole edilen toplam 96 enterokok suşu; E.faecalis 38 (%39.6), E.faecium 27 (%28.1), E.raffinosus 8 (%8.3), E.durans 7        (%7.3), E.hirae 7 (%7.3), E.avium 5 (%5.2), E.pseudoavium 3 (%3.1) ve E.dispar 1 (%1) olarak izole edilmiştir. İzole edilen enterokok suşları sayı ve oranları tablo-VIII‘de gösterilmiştir.

Tablo-VIII: Besicilerde izole edilen Enterokokların sayı ve oranları
enterokok türleri	              sayı	%	 
E.faecalis	38	39.6	
E.faecium	27	28,1	 
E.raffinosus	8	8.3	 
E.durans	7	7.3	 
E.hirae	7	7,3	 
E.avium	5	5.2	 
E.pseudoavium	3	3.1	 
E.dispar	1	1.0	 
Toplam	96	100,0	 
       
 Tüm suşların yüksek düzey gentamisin (120 g) ve yüksek düzey streptomisin (300 g) duyarlılıklarına disk difüzyon yöntemiyle bakılmış; hepsi yüksek düzey gentamisine duyarlı, 1 suş yüksek düzey streptomisine dirençli bulunmuştur. Streptomisine dirençli olan bu suş vankomisin ve teikoplanine duyarlı; ancak diğer antibiyotiklere dirençli olarak bulunmuştur. Penisilin duyarlılıkları; 7 suş dirençli ve 1 suş orta derece duyarlı bulunmuştur. Penisilin dirençli suşların 5’i E.faecium, 2’si E.durans’tır. 

       Çalışmamızda besicilerden izole edilen suşlarda 96 suşta ampisilin direnci %2.1, penisilin direnci %8.3, sefaklor direnci %42.7, siprofloksasin direnci %78.6, sefalotin direnci %32.3, tetrasiklin direnci %34 olarak bulunmuştur Ayrıca izole edilen suşlarda beta-laktamaz aktivitesine rastlanmamıştır. Besicilerden izole edilen enterokokların antibiyotik direnç durumları Tablo-IX‘da gösterilmiştir.

antibiyotik	E.faecalis
(38 suş)	E.faecium 
(27 suş)	E.raffinosus
(8 suş)	E.durans
(7 suş)	E.hirae
(7 suş)	E.avium
(5 suş)	E.pseudoavium
(3 suş)	E.dispar
(1 suş)	
Gentamisin*	0	0	0	0	0	0	0	0	
Streptomisin**	0	1	0	0	0	0	0	0	
Penisilin	0	5	0	2	1	0	0	0	
Ampisilin	0	0	0	2	0	0	0	0	
Sefaklor	21	12	0	1	4	1	2	0	
Siproflaksasin	29	23	7	2	7	3	3	1	
Sefalotin	14	9	0	2	5	0	1	0	
Tetrasiklin	16	6	2	2	3	1	3	0	

Tablo-IX: Besicilerden izole edilen enterokokların antibiyotiklere direnç durumları

* : Yüksek düzey gentamisin, ** : Yüksek düzey streptomisin

           Bu çalışmada 72 sığırdan alınan  rektal sürüntü ve dışkı örnekleri incelenmiştir. Alınan her rektal sürüntü ve dışkı örneği ECA ve ECB besiyerlerine ekilmiştir. VRE izolasyonunu kolaylaştırmak için 6g/ml vankomisin içeren ECA ve ECB besiyerlerine de ekilmiştir. ECB besiyerinde 48 saat inkubasyondan sonra ECA besiyerine pasajlanmıştır

           Bu çalışmada 72 sığırdan 65’inde (%90.2) enterok türleri izole edilmiştir. Vankomisin ve teikoplanine dirençli enterokok türü izole edilmemiştir. Bu çalışmada sığırlardan izole edilen enterokok sayı ve oranları Tablo-X’da gösterilmiştir

          Direkt ekilen rektal sürüntü örneklerinde 72 sığırdan 34’ünde (%47.2) enterokok izole edilmiştir. ECB besiyerinde 48 saatlik inkubasyondan sonra ECA besiyerine ekilen örneklerde 56’sında (%77.8) enterokok izole edilmiştir. İkisi arasındaki fark çok anlamlı bulunmuştur 
(χ2 McNemar=11.605, SD=1, p=0.001)(tablo:XI).

        Rektal sürüntü örneklerinin ekildiği 6g/ml vankomisin içeren ECA besiyerinde ise 12’inden (%16.7) enterokok izole edilmiştir. Vankomisin (6g/ml) içeren ECB besiyerinde (ECB-VA) 48 saatlik inkubasyondan sonra ekilen örneklerde ise 24’ünde (%33.3) enterokok izole edilmiştir. 

Direkt ekilen dışkı örneklerinde 72 sığırdan 38’inde (%52.8) enterokok izole edilmiştir. ECB besiyerinde inkübe edildikten sonra ekilen dışkı örneklerinde 58’inde(%80.6) enterokok izole edilmiştir. Enterokok izolasyonu açısından sığırlarda dışkı örneklerinde  ECA ve ECB besiyerleri arasında istatistiksel olarak çok anlamlı fark bulunmuştur (χ2McNemar=11.281, SD=1, p=0.001)(tablo:XII).

Sığırlarda ECA ve ECB besiyerinde enterokok izolasyonu açısından rektal sürüntü ve dışkı örnekleri arasında fark bulunmamıştır (p>0.5)Tablo:XIII-Tablo-XIV).

Tablo-X: Bu çalışmada sığırlardan izole edilen enterokok sayı ve oranları :                      
	kullanılan besiyeri	Sayı	%	
Rektal sürüntü	ECA
ECA-VA
ECB
ECB-VA	34
12
56
24	47.2
16.7
77.8
33.3	
Dışkı	ECA
ECA-VA
ECB
ECB-VA	38
17
58
40	52.8
23.6
80.6
55.5	
	Toplam	65	90.2	

Tablo-XI: Sığırlarda rektal sürüntü örneklerinde ECA ve ECB besiyerlerinde enterokok izolasyonu dağılımı

ECA	ECB	
TOPLAM	
	+	-		
+
-
TOPLAM	26
30
56	8
8
16	34
38
72	

Rektal sürüntü örneklerinde enterokok izolasyonu açısından ECA ve ECB besiyerleri arasında istatistiksel olarak çok anlamlı fark vardır (χ2McNemar=11.605, SD=1, p=0.001).

Tablo-XII: Sığırlarda dışkı örneklerinde ECA ve ECB besiyerlerinde enterokok izolasyonu dağılımı

ECA	ECB	
TOPLAM	
	+	-		
+
-
TOPLAM	32
26
58	6
8
14	38
34
72	

Enterokok izolasyonu açısından sığırlarda dışkı örneklerinde  ECA ve ECB besiyerleri arasında istatistiksel olarak çok anlamlı fark vardır.(χ2McNemar=11.281 ,  SD=1, p=0.001).

Tablo-XIII: Sığırlarda rektal sürüntü ve dışkı  örneklerinin ECA besiyerlerinde enterokok izolasyon dağılımı
Rektal sürüntü    ECA	Dışkı ECA	
TOPLAM	
	+	-		
+
-
TOPLAM	20
18
38	14
20
49	34
38
72	
ECA besiyerinde enterokok izolasyonu açısından rektal sürüntü ve dışkı örnekleri arasında fark bulunmamıştır (p>0.5).

Tablo-XIV: Sığırlarda rektal sürüntü ve dışkı  örneklerinin ECB besiyerlerinde enterokok izolasyon dağılımı

Rektal sürüntü ECB	Dışkı ECB	
TOPLAM	
	+	-		
+
-
TOPLAM	48
10
58	8
6
31	56
16
72	

ECB besiyerinde enterokok izolasyonu açısından rektal sürüntü ve dışkı örnekleri arasında fark bulunmamıştır (p>0.5).

Sığırlarda 65 suş; 21(%32.3) E.faecalis, 16 (%24.6) E.faecium, 9 (%13.8) E.durans, 5 (%7.7) E.hirae, 4 (%6.2) E.avium, 4 (%6.2) E.pseudoavium, 3 (%4.6) E.raffinosus ve 3 (%4.6) E.dispar olarak tanımlanmıştır (Tablo-XV).       
Tablo-XV: Sığırlarda izole edilen Enterokokların sayı ve oranları
enterokok türleri	sayı	%	 
E.faecalis	21	32.3	
E.faecium	16	24.6	 
E.durans	9	13.8	 
E.hirae	5	7.7	
E.avium	4	6.2	 
E.pseudoavium	4	6.2	 
E.raffinosus	3	4.6	 
E.dispar	3	4.6	 
Toplam	65	100,0	 

         Tüm suşların yüksek düzey gentamisin (120 g) ve yüksek düzey streptomisin (300 g) duyarlılıklarına disk difüzyon yöntemiyle bakılmış;        Sığırlardan izole edilen 65 enterokok suşunda 6 tanesinde yüksek düzey gentamisin direnci bulunmuştur. Bunlardan 2’si E.faecalis, 2’si E.durans ve 2’si de E.hirae’dir. Sığırlarda yüksek düzey streptomisin direnci saptanmamıştır. Ampisilin direnci %10.8, sefaklor direnci %10.8, siprofloksasin direnci %15.3, sefalotin direnci %23.1 olarak bulunmuştur. Sığırlardan izole edilen suşlarda penisilin ve tetrasiklin dirençli suş bulunmamıştır. İzole edilen enterokok suşlarının direnç durumları tablo-XVI’da gösterilmiştir.

Tablo-XVI: sığırlardan izole edilen enterokokların antibiyotiklere direnç durumları:

Antibiyotik	E.faecalis
(21 suş)	E.faecium (16 suş)	E.durans
(9 suş)	E.hirae
(5 suş)	E.avium
(4 suş)	E.pseudoavium
(4 suş)	E.dispar
(3 suş)	E.raffinosus
(3 suş)	
Gentamisin*	2	0	2	2	0	0	0	0	
Streptomisin**	0	0	0	0	0	0	0	0	
Penisilin	0	0	0	0	0	0	0	0	
Ampisilin	1	2	0	2	1	0	1	0	
Sefaklor	1	1	3	2	0	0	0	0	
Siprofloksasin	3	4	0	0	1	0	1	1	
Sefalotin	3	2	4	4	0	1	0	1	
Tetrasiklin	0	0	0	0	0	0	0	0	
* : Yüksek düzey gentamisin, ** : Yüksek düzey streptomisin

TARTIŞMA
        
Enterokoklar toprakta, suda, gıdalarda, hayvanlarda, kuşlarda ve böceklerde doğal olarak bulunurlar. İnsanlarda özellikle gastrointestinal sistem ve genitoüriner sistemde yerleşirler. İnsan dışkısından elde edilen enterokok türleri coğrafi ve beslenmeye bağlı değişiklikler gösterirler. (2-5).

Enterokoklar uzun süredir en önemli endokardit etkeni olarak bilinir. Çoklu antibiyotik direnci ve nozokomiyal infeksiyonlarda etkenler arasında sıklıkla saptanmaları önemlerini artırır. ABD’de enterokoklar nozokomiyal üriner sistem ve yara etkenleri arasında 2.sırada, nozokomiyal bakteriyemi etkenleri arasında da 3.sırada yeralmaktadır (1-6).

Enterokokların çoğu beta-laktam ve glikopeptid antibiyotiklerin bakterisidal etkisine tolerans gösterir. Bu nedenle endokardit ve menenjit gibi ağır infeksiyonlarda bu antibiyotiklerin kombine olarak kullanılması gerekir. Vankomisine dirençli ilk E.faecalis suşları 1980’li yılların sonlarında İngiltere ve Fransa’da bildirilmiştir. Kısa bir süre içinde Avrupa ülkelerine ve ABD’ye yayılmıştır. VRE’ye bağlı hastane epidemileri bildirilmiştir (4). ‘Centers for Disease Control and Prevention’a (CDC) bağlı National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) sisteminin raporuna göre 1989’dan 1993’e kadar nozokomiyal VRE infeksiyonu oranı %0.3’den %7.9’a çıkmıştır. Özellikle yoğun bakım ünitelerinde bu oran %0.4’den %13.6’ya çıkmıştır (1,4). Hem Van A hem de Van B tipi hastane epidemileri bildirildiği belirtilmektedir (2,5,7).

Avrupa’da VRE kolonizasyonundaki artışta önemli bir faktör hayvan yemlerinde büyütme faktörü olarak kullanılan glikopeptid yapısında bir antibiyotik olan avoparsinin kullanılmasıdır. Avrupa’da 1997 yılına kadar et üretimini artırmak amacıyla avoparsin yoğun olarak kullanılmıştır. Avoparsin kullanımı VRE suşlarının hayvanlardan insanlara geçişine yol açmıştır. Buna bağlı olarak hayvanlarda, kesimhanelerde ve çiftlikte çalışanlarda VRE kolonizasyonunda büyük bir artış saptanmıştır (2,5-8,24,25). 

Ancak avoparsinin hayvanlarda bir büyütme faktörü olarak hiç kullanılmadığı ABD’de yapılan çeşitli çalışmalarda hastane dışında VRE kolonizasyonunun sık görülmediği bunun daha çok nozokomiyal bir sorun olduğu anlaşılmıştır. ABD’deki ilk çalışmalar VRE ile kolonize olan veya infekte olan hastaların daha çok yoğun bakım hastaları olduğunu göstermiştir. Daha sonra yapılan çalışmalar ise hastanede yatan tüm hastalar ve altta yatan bir hastalığı olanlarda önemli bir sorun haline gelmeye başladığını göstermiştir (4).

Sağlıklı kişilerde VRE kolonizasyonu ciddi bir infeksiyon riski oluşturmamaktadır. Belçika’da 1993 yılında bir hastanede yapılan bir nokta prevalans çalışmasında hastalara ait dışkı örneklerinin %3.5’inde VRE izole edildiği ancak o zamana kadar hiç VRE infeksiyonu saptanmadığı bildirilmiştir (26). 

VRE çeşitli çevresel örneklerden ve gıdalardan da izole edilmektedir. Klein ve ark. Almanya’da çiğ biftek ve domuz etinde VRE araştırmışlar ve örneklerin %8’inde VRE saptamışlardır (27). Hollanda’da yapılan bir çalışmada etlerde VRE izolasyonu %79 olarak bulunmuştur (28). Robredo ve ark. İspanya’da yaptıkları çalışmalarında tavuk ürünlerinde %27.2, mezbahalardaki tavuk bağırsak örneklerinde %16 oranında VRE izole etmişlerdir. Hindi eti ürünlerinde VRE izole edememişlerdir (29). Yoshimura ve ark. Japonya’da avoparsinin büyütme faktörü olarak kullanıldığı tavuklarda VRE kolonizasyonunu %3 olarak bulmuşlardır (30).

 Yapılan çeşitli çalışmalarda avoparsin kullanılmasının yasaklanmasından sonra VRE kolonizasyonunda çok anlamlı azalmalar görülmüştür. Aarestrup ve ark. Danimarka‘da 1995-2000 yılları arasında yaptıkları bir çalışmada 1995’te Brolier cinsi tavuklarda %72.7 olan VRE kolonizasyon oranını 2000 yılında %5.8 olarak bulmuşlardır. Domuzlarda bu oran 1995’te %20 iken 2000 yılında %6’ya düşmüştür (31).

Ülkemizde ise avoparsin içeren yem katkı maddeleri büyütme faktörü olarak ithal edilmeye başlanmış ancak 30 Haziran 1999 tarihinde Tarım ve Köyişleri Bakanlığı’nın bir tebliği ile yasaklanmıştır (19).
 
Bu çalışmada 111 besicide ve 72 sığırdan rektal sürüntü ve dışkı örnekleri alınmış ve VRE kolonizasyonu araştırılmıştır. Yüzonbir besiciden 96’sında (%86.4) ve 72 sığırdan 65’inde (%90.2) enterok türleri izole edilmiştir. Vankomisin ve teikoplanine dirençli enterokok türü izole edilmemiştir.

Coque ve ark. hindi ve tavuk çiftliği çalışanlarından oluşan 104 sağlıklı gönüllüde ve 100 hastanede yatan hastada dışkı örneklerinde yaptıkları çalışmada sağlıklı gönüllülerde %80 ve hastanede yatan hastalarda %75 enterokok taşıyıcılığı bulmuşlardır. Hastanede yatanlarda %16, gönüllülerde %3.8 oranında VRE izole etmişlerdir (32).
 
Padiglone ve ark. Avusturalya’da 1085 sağlıklı kişide yaptıkları çalışmada fekal örneklerden randomize olarak seçtikleri 112 örnekte 106 sında enterokok izole etmişler ve 2 sinde VRE saptamışlardır (33). Gordts ve ark. Belçika’da yatan hastalarda gastrointestinal sistemde VRE kolonizasyonunu araştırmışlardır. Çalışmalarında 636 hastadan 22’sinde (%3.5) VRE taşıyıcılığı saptamışlardır (26). Singh-Naz ve ark. ABD ‘de hematoloji/onkoloji ünitesinde yatan çocuklarda yaptıkları çalışmalarında VRE kolonizasyonunu araştırmışlar. Kolonizasyon oranını %24 olarak bulmuşlardır (34).

Bonten ve ark. ABD’de yaptıkları bir çalışmada yoğun bakım ünitesinde solunum cihazına bağlı  hastalarda %24 ve diğer hastalarda %6 VRE izole etmişlerdir (35). Gambarotto ve ark. Fransa‘da kırsal alanda bir sığır yetiştirme bölgesinde hastanede yatan hematoloji hastalarında ve kontrol grubunda VRE araştırmışlardır. Hastanede yatan hematoloji hastalarında %37 ve kontrol grubunda %21.8 VRE taşıyıcılığı bulmuşlardır (36). Stobberingh ve ark. Hollanda’da hindi çiftliklerinde çalışanlarda, kasaplarda, hindilerde ve aynı bölgede yaşayan sağlıklı gönüllülerde vankomisin içeren (10µg/ml) ve içermeyen KF Streptococcus agar kullanarak yaptıkları çalışmalarında VRE kolonizasyonunu araştırmışlardır. Vankomisin içermeyen 282 plakta; hindilerde %4, hindi çiftliği çalışanlarında %7, aynı bölgede yaşayan sağlıklı gönüllülerde %2 VRE izole etmişlerdir. Vankomisin içeren 59 plakta; hindi çiftliği çalışanlarında %81, kasaplarda %100 hindilerde %91 ve aynı bölgede yaşayan sağlıklı gönüllülerde %86 oranında VRE izole etmişlerdir (37). Ieven ve ark. VRE’nin gastrointestinal kolonizasyonunu %12.8 olarak bulmuşlardır (38). 

Ülkemizde ilk VRE suşu 1998 yılında Vural ve ark. tarafından Akdeniz Üniversitesinde izole edilmiştir (39). Ülkemizde VRE taşıyıcılığı ile ilgili olarak Yüce ve ark. yenidoğanlarda yaptıkları çalışmalarında 110 rektal sürüntü örneği enterokok yönünden incelenmiş ve 8 örnekte (%7) VRE tesbit etmişlerdir (40). Ersoy çalışmasında Malatya ve komşu illerde enterokok izolatları arasındaki VRE insidansını %4.7 olarak bulmuştur (41).

Moaddab ve Töreci çalışmalarında çeşitli muayene maddelerinde izole ettikleri 100 enterokok suşunun tamamını vankomisine duyarlı bulmuşlardır. Yatan hastaların dışkı örneklerinden izole ettikleri 198 suşun 11’ini vankomisine orta derece duyarlı bulmuşlardır (42). Gelişken Akgül ve Sümerkan 126 enterokok suşunda VRE saptayamamışlardır (43).

VRE için en önemli rezervuar gastrointestinal sistemdir ve infeksiyon olgularının çoğunda ilk önce gastrointestinal kolonizasyon saptanır. Daha nadir olmakla birlikte sürveyans amacıyla alınan burun, boğaz, ağız veya cilt kültürlerinde de VRE saptanabilir. Ancak VRE kolonizasyonunu saptamak için en güvenilir yol gastrointestinal sistemin araştırılmasıdır (4).
         
Bu çalışmada rektal sürüntü ve dışkı örnekleri alınmış ve ECA ve ECB besiyerleri kullanılmıştır. Dışkı ve rektal sürüntü örnekleri  vankomisinli ve vankomisinsiz olarak ECA ve ECB besiyerlerine ekilmiştir. Vankomisinli besiyerine ekilmesindeki amaç VRE izolasyonunu kolaylaştırmaktır. 

Besicilerde direkt ECA besiyerine ekilen rektal sürüntü örneklerinde 111 örneğin 61’inde (%54.9), ECB besiyerinde 48 saatlik inkubasyondan sonra ekilen örneklerde ise 80’inde (%72.1) enterokok izole edilmiştir. İkisi arasındaki fark çok anlamlı bulunmuştur (p=0.001). Direkt ECA besiyerine ekilen dışkı örneklerinin 62’sinde (%55.8), ECB besiyerinde inkübe edildikten sonra ekilen örneklerin 80’ninde (%72.1) enterokok izole edilmiştir. Dışkı örneklerinde de enterokok izolasyonu açısından ECA ve ECB besiyerleri arasında çok anlamlı fark bulunmuştur (p=0.001)(tablo-V).

Sığırlarda rektal sürüntü örneklerinde direk ECA besiyerine ekilen 72 örnekten 34’ünde (%47.2), ECB besiyerinde 48 saatlik inkubasyondan ekilen örneklerden 56’sında (%77.8) enterokok izole edilmiştir. İkisi arasındaki fark çok anlamlı bulunmuştur (p=0.001)(tablo-XI). Direkt ekilen dışkı örneklerinde 72 sığırdan 38’inde (%52.8), ECB da inkübe edildikten sonra ekilen dışkı örneklerinin 58’inde (%80.6) enterokok izole edilmiştir. Enterokok izolasyonu açısından sığırlarda dışkı örneklerinde de ECA ve ECB besiyerleri arasında istatistiksel olarak çok anlamlı fark bulunmuştur (p=0.001)(tablo-XII).

 Van Horn ve ark. 173 perianal sürüntü örneğinde  herbiri 6g vankomisin içeren Enterococcosel broth, M-entorococcus broth ve CNA besiyerlerini karşılaştırmışlar ve en yüksek VRE izolasyonunu Enterococcosel broth ile sağlamışlardır. Hızlı ve seçici VRE izolasyonu için Enterococcosel broth besiyeri daha uygun bulunmuştur (44). Ieven ve ark. 213 dışkı ve 122 rektal sürüntü örneğini 6g vankomisin içeren ECA ve daha sonra 6g vankomisin içeren ECB içine ekilmiş, 23 tanesi hem ECA hem ECB besiyerinde üremiş ancak 20 tanesi sadece ECB zenginleştirme yöntemiyle izole edilmiştir. 
Bu çalışmada da besicilerdeki 111 rektal sürüntü örneğinde izole edilen enterokokların 57 tanesi hem ECA hem ECB besiyerinde, 23 tanesi sadece ECB besiyerinde izole edilmiştir.
       Landmann ve ark. ABD’de yaptıkları çalışmalarında 5 seçici besiyerini karşılaştırmışlar. En yüksek izolasyon oranını ECB besiyerinde %88 olarak elde etmişlerdir (45).

Gambarotto ve ark. dışkı ve rektal sürüntü örneklerini 6g vankomisin içeren Bile-Esculin agar ve broth besiyerlerine ayrıca vankomisinsiz olarak aynı besiyerlerine ekim yapmışlardır (36). Singh-Naz ve ark. 10 g vankomisin içeren Campy Blood agar kullanmışlardır.
Yoshimura ve ark. örnekleri Bile-esculin azide agar besiyerine ekmişlerdir (30).
         Weinstein ve ark. VRE kolonizasyonu ile ilgili araştırmalarında perirektal ve rektal sürüntü örneklerini karşılaştırmışlardır. Her iki yöntemin eşit duyarlılığa sahip olduğunu göstermişlerdir (46). 
    
Bu çalışmada besicilerde ve sığırlarda enterokok izolasyonu açısından rektal sürüntü ve dışkı örnekleri arasında fark bulunmamıştır.

Bu çalışmada besicilerden izole edilen toplam 96 enterokok suşunun 38’i (%39.6) E.faecalis, 27’si (%28.1) E.faeciumdur. E.raffinosus 8 (%8.3), E.durans 7 (%7.3), E.hirae 7 (%7.3), E.avium 5 (%5.2), E.pseudoavium 3 (%3.1) ve E.dispar 1 (%1) olarak izole edilmiştir. Sığırlarda 65 suş; 21 (%32.3) E.faecalis, 16 (%24.6) E.faecium, 9 (%13.8) E.durans, 5 (%7.7) E.hirae, 4 (%6.2) E.avium, 4 (%6.2) E.pseudoavium, 3 (%4.6) E.raffinosus ve 3 (%4.6) E.dispar olarak tanımlanmıştır.

Moaddab ve Töreci çalışmalarında çeşitli muayene maddelerinden izole ettikleri 100 enterokok suşunun 86’sını E.faecalis, 11’ini E.faecium, 2’sini E.raffinosus ve birini E.avium olarak identifiye etmişlerdir. Yatan hastaların dışkılarından izole ettikleri 198 enterokok suşunun 90’ını (%45) E.faecalis, 85’ini (%43) E.faecium, 14’ünü (%7) E.avium, 7’sini (%3.5) E.raffinosus, ve birerini E.durans (%0.5) ve E.hirae (%0.5) olarak identifiye etmişlerdir (42).  

           Karadenizli ve Kolaylı çalışmalarında çeşitli klinik örneklerden izole edilen 144 enterokok suşunda enterokok türlerini ; E.faecalis %64.6, E.faecium %29.8, E.durans/E.hirae %2.8, E.raffinosus, %1.4 ve E.casseliflavus/E.gallinarum %1.4 olarak bulmuşlardır.
 Robredo ve ark. Toplam 33 örnekte 11 E.durans 10 E.faecalis, 10 E.faecium ve 2 E.hirae izole etmişlerdir (47).
       Klein ve ark. Almanya’da çiğ biftek ve domuz etinde %87 E.faecalis, %4 E.faecium, %3 E.casseliflavus, %2 E.gallinarum, %2 E.durans, %1 E.hirae ve %1 E.avium olarak bulmuşlardır (27). Singh-Naz ve ark. tüm suşları E.faecium olarak izole etmişlerdir (34).

Çınar ve ark. 111 klinik izolattan elde ettikleri enterokok suşlarını E.faecalis %67.6, E.faecium %30.6, E.avium %0.9 ve E.casseliflavus %0.9 olarak tanımlamışlardır (48).

        Bu çalışmada tüm suşların yüksek düzey gentamisin (120 g) ve yüksek düzey streptomisin (300 g) duyarlılıklarına disk difüzyon yöntemiyle bakılmış; hepsi yüksek düzey gentamisine duyarlı bulunmuş, 1 suş yüksek düzey streptomisine dirençli bulunmuştur. Streptomisine dirençli olan bu suş vankomisin ve teikoplanine duyarlı; ancak diğer antibiyotiklere dirençli olarak bulunmuştur. Sığırlardan izole edilen 65 enterokok suşunda ise 6 tanesinde yüksek düzey gentamisin direnci bulunmuştur. Bunlardan 2’si E.faecalis, 2’si E.durans ve 2’si de E.hirae’dir. Sığırlarda yüksek düzey streptomisin direnci saptanmamıştır. 
    
          Aminoglikozidlere karşı doğal direnç düşük düzeyde olup antibiyotiklerin hücre içi penatrasyonundaki yetersizlik sonucu gözlenir. Bu direnç aminoglikozidler hücre duvarına etkili bir ajanla birlikte kullanıldığında aşılabilir (2,5,19).
Yüksek düzeyde aminoglikozid direnci ya ribozomal mutasyon (sadece streptomisin için) yada plazmidle aktarılan aminoglikozid modifiye edici enzimlere bağlı olarak ortaya çıkar. Bu tür dirençte beta-laktam antibiyotiklerle sinerjistik etkileşim söz konusu değildir (2,3,5,7).
Gentamisine karşı yüksek düzey direncin saptanması 2’’APH-6’ AAC enziminin varlığını düşündürmektedir. Bu enzim streptomisin dışında tüm aminoglikozidleri inaktive ettiği için rutinde yalnızca streptomisin ve gentamisine karşı yüksek düzey de direncin araştırılması yeterlidir (19). 

Çalışmamızda besicilerden izole edilen 96 suşta ampisilin direnci %2.1, penisilin direnci %8.3, sefaklor direnci %42.7, siprofloksasin direnci %78.6, sefalotin direnci %32.3, tetrasiklin direnci %34 olarak bulunmuştur.
Sığırlardan izole edilen 65 suşta ampisilin direnci %10.8, sefaklor direnci %10.8, siprofloksasin direnci %15.3, sefalotin direnci %23.1, olarak bulunmuştur. Sığırlarda  penisilin ve tetrasiklin dirençli suş bulunmamıştır.   
       
        Hoşgör ve ark. yüksek düzey gentamisin direncini %23, yüksek düzey streptomisin direncini %20 olarak bulmuşlardır (48). 
Esen ve arkadaşları çeşitli klinik örneklerden izole edilen 101 enterokok suşunda %43 yüksek düzey gentamisin direnci, %33 ampisilin direnci ve %52 penisilin direnci bulmuşlardır (49).
 Öğünç ve ark. 100 nozokomiyal enterokok suşunda %30 yüksek düzey gentamisin direnci saptamışlardır (50).

         Karadenizli ve Kolaylı çalışmalarında çeşitli klinik örneklerden izole edilen 114 enterokok suşunun %26.4’ünde yüksek düzey gentamisin direnci ve %22.2’sinde yüksek düzey streptomisin direnci saptamışlar ve enterokok suşlarının %24.3’ünde ampisilin direnci bulmuşlardır (47).  
 Çınar ve ark. 111 klinik izolattan elde edilen enterokok suşlarında yüksek düzey gentamisin direncini %50.5, yüksek düzey streptomisin direncini %41.4 ve penisilin direncini %52.3 olarak bulmuşlardır (51).           
       
 Moaddab ve Töreci çalışmalarında çeşitli muayene maddelerinden ve yatan hastaların dışkılarından  izole ettikleri 298 enterokok suşunda yüksek düzey gentamisin direncini %13, yüksek düzey streptomisin direncini %18 olarak bulmuşlardır. Penisilin direncini %28, ampisilin direncini %22, siprofloksasin direncini %8 olarak bulmuşlardır.
       Klein ve ark. Almanya’da çiğ biftek ve domuz etinden izole ettikleri  209 enterokok izolatında penisilin duyarlılığını %95.5, ampisilin duyarlılığını %100, tetrasiklin duyarlılığını %79.9, siprofloksasin duyarlılığını %64.1, sefalotin duyarlılığını %8.1, gentamisin duyarlılığını %100 ve streptomisin duyarlılığını %95.5 olarak bulmuşlardır. Vankomisin ve teikoplanin direnci saptayamamışlardır (27).
            
        Sonuç olarak bu çalışmada sığırlarda ve besicilerde VRE kolonizasyonuna rastlanmamıştır. Bunun nedeninin 1999’dan beri avoparsin kullanımının ülkemizde yasak olmasının olabileceği düşünülmektedir. Bu çalışmada enterokok izolasyonu için Enterococcosel agar besiyerine direkt ekim yerine Enterococcosel broth besiyerinde inkubasyondan sonra ekim yapılmasının daha uygun olabileceği sonucuna varılmıştır.

SONUÇLAR

1.	Bu çalışmada 111 besici ve 72 sığırdan alınan dışkı ve rektal sürüntü örneklerinde vankomisine dirençli enterokok araştırılmıştır. Her örnek Enterococcosel agar ve Enterococcosel broth besiyerlerine vankomisinli (6µg/ml) ve vankomisinsiz olarak ekilmiştir.

2.	Besicilerden 96 ve sığırlardan 65 enterokok suşu izole edilmiştir. Besicilerden izole edilen 96 suş; E.faecalis 38 (%39.6), E.faecium 27 (%28.1), E.raffinosus 8 (%8.3), E.durans 7 (%7.3), E.hirae 7 (%7.3), E.avium 5 (%5.2), E.pseudoavium 3 (%3.1) ve E.dispar 1(%1) olarak identifiye edilmiştir. Sığırlardan izole edilen 65 suş 21 (%32.3) E.faecalis, 16 (%24.6) E.faecium, 9 (%13.8) E.durans, 5 (%7.7) E.hirae, 4 (%6.2) E.avium, 4 (%6.2) E.pseudoavium, 3 (%4.6) E.raffinosus ve 3 (%4.6) E.dispar olarak identifiye edilmiştir.

3.	Vankomisin, teikoplanin, yüksek düzey gentamisin, yüksek düzey streptomisin dahil olmak üzere toplam 10 antibiyotik duyarlılığı disk difüzyon yöntemiyle araştırılmıştır 

4.	Vankomisin ve teikoplanine dirençli enterokok suşu izole edilmemiştir. 

5.	Besicilerde 1 tane yüksek düzey streptomisine dirençli suş, sığırlarda ise 6 yüksek düzey gentamisin dirençli suş bulunmuştur. Besicilerden izole edilen suşlarda 96 suşta ampisilin direnci %2.1, penisilin direnci %8.3, sefaklor direnci %42.7, siprofloksasin direnci %78.6, sefalotin direnci %32.3, tetrasiklin direnci %34 olarak bulunmuştur. Sığırlardan izole edilen enterokok suşlarında ampisilin direnci %10.8, sefaklor direnci %10.8, siprofloksasin direnci %15.3 ve sefalotin direnci %23.1 olarak bulunmuştur. Sığırlardan izole edilen enterokok suşlarında penisilin ve tetrasiklin dirençli suş saptanmamıştır.

6.	Enterokok izolasyonu için Enterococcosel agar besiyerine direkt ekim yerine Enterococcosel broth besiyerinde inkubasyondan sonra ekim yapılmasının daha uygun olacağı sonucuna varılmıştır.

ÖZET

               Bu çalışmada Denizli ve çevresindeki 111 besici ve 72 sığırdan alınan dışkı ve rektal sürüntü örneklerinde vankomisine dirençli enterokok kolonizasyonu araştırılmıştır. Herbir dışkı ve rektal sürüntü örneği   vankomisin(6 µg/ml) içeren ve içermeyen olmak üzere Enterococcosel agar ve Enterococcosel broth besiyerlerine ekilmiştir. Enterococcosel agar 24 saat, Enterococcosel broth 48 saat inkube edilmiştir. Yüzonbir besiciden 96 (%84.6) enterokok suşu izole edilmiştir. Bunlar E.faecalis 38 (%39.6), E.faecium 27 (%28.1), E.raffinosus  8 (%8.3), E.durans 7 (%7.3), E.hirae 7 (%7.3), E.avium 5 (%5.2), E.pseudoavium 3 (%3.1) ve E.dispar 1(%1) olarak identifiye edilmiştir. Sığırlardan izole edilen 65 suş 21 (%32.3) E.faecalis, 16 (%24.6) E.faecium, 9 (%13.8) E.durans, 5 (%7.7) E.hirae, 4 (%6.2) E.avium, 4 (%6.2) E.pseudoavium, 3 (%4.6) E.raffinosus  ve 3 (%4.6) E.dispar olarak tanımlanmıştır. 
   
      Vankomisin ve teikoplanine dirençli enterokok suşu izole edilmemiştir. Besicilerde 1 tane yüksek düzey streptomisine dirençli suş, sığırlarda ise 6 yüksek düzey gentamisin dirençli suş bulunmuştur..

          Besicilerden izole edilen suşlarda 96 suşta ampisilin direnci %2.1, penisilin direnci %8.3, sefaklor direnci %42.7, siprofloksasin direnci %78.6, sefalotin direnci %32.3, tetrasiklin direnci %34 olarak bulunmuştur. Sığırlardan izole edilen enterokok suşlarında ampisilin direnci %10.8, sefaklor direnci %10.8, siprofloksasin direnci %15.3, sefalotin direnci %23.1 olarak bulunmuştur. Sığırlardan izole edilen enterokok suşlarında penisilin ve tetrasiklin dirençli suş saptanmamıştır.
 
          Enterokok izolasyonu açısından rektal sürüntü ve dışkı örnekleri arasında anlamlı bir fark bulunmamıştır. Enterococcosel broth besiyeri enterokok izolasyonu için Enterococcosel agar besiyerine göre daha uygun bulunmuştur.

          Bu çalışmada vankomisine dirençli enterokok izole edilememesinin nedeninin ülkemizde avoparsin kullanımının yasaklanmış olmasına bağlı olabileceği düşünülmektedir.

SUMMARY

THE INVESTİGATON OF VANCOMYCIN RESISTANT ENTEROCOCCI IN CATTLE FARMERS

In this study , vancomycin resistant enterococci (VRE) colonization was investigated in stools and rectal swabs which were obtained from 111 cattle farmers and 72 cattle in Denizli. Each stool specimens and rectal swabs were inoculated onto Enterococcosel agar plate with and without vancomycin (6µg/ml) and into Enterococcosel Broth suplemented with  and without vancomycin (6µg/ml). The plates incubated 37 0C for 24 h. The broths incubated 37 0C for 48 h. The enterococci species which isolated from 96 of 111 cattle farmers were included 38 E.faecalis (39.6%), 27 E.faecium (28.1%), 8 E.raffinosus (8.3%), 7 E.durans (7.3 %), 7 E.hirae (7.3%), 5 E.avium (5.2%), 3 E.pseudoavium (3.1%)  and 1 E.dispar (1%) isolates. The enterococci species which isolated from 65 of 72 cattles were included 21 E.faecalis (32.3%), 16 E.faecium (24.6%), 9 E.durans (13.8%), 5 E.hirae (7.7%), 4 E.avium (6.2%), 4 E.pseudoavium (6.2%), 3 E.raffinosus (4.6%) and 3 E.dispar (4.6%) isolates.

It wasn’t isolated vancomycin and teicoplanin resistant enterococcus strains from cattle and cattle farmers. One high level streptomycin resistant enterococci was found in cattle farmers. Six high level gentamycin resistant enterococci were found in cattles.

In this study we found that 2.1% ampicillin resistance, 8.1% penicillin resistance, 42.7% cefaclor resistance, 78.6% ciprofloxacin resistance, 32.3% cephalotin resistance and 34% tetracycline resistance in 96 enterococcus strains from cattle farmers. 10.8% ampicillin resistance, 10.8% cefaclor resistance, 15.3% ciprofloxacin resistance and 23.1% cephalotin resistance in 65 enterococcus strains from cattles. It was not determined that penicillin and tetracycline resistance to enterococcus strains which were isolated from cattles. 

It wasn’t found that there were a significant difference between rectal swabs and stool specimens for enterococci isolation. It was found that Enterococcosel broth was better than Enterococcosel agar for enterococcus isolation. 

We think that the reason for no VRE in our study is banned to use of avoparsin.

KAYNAKLAR

1.	NNIS Report. 1997. National nosocomial infections surveillance (NNIS) report, data summary from October 1986-April 1997. Am. J. Infect. Control  1997; 25:477-487.

2.	Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schrechenberger PC, Winn WC Jr. The Gram-positive cocci. Part II: Streptococci, Enterococci and streptococcus-likebacteria Color atlas and textbook of diagnostic microbiology, Philadelphia; JB Lippincott, 1997:577-677.

3.	Facklam RR, Sahm DF, Teixeira LM. Enterococcus: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC,Yolken YH. Manual of clinical microbiology. Washington: ASM .1999:297-305.

4.	Cetinkaya Y, Falk P,Mayhall G. Vancomycin-resistant enterococci. Clin Microbiol Rev 2000 ;13:686-707.

5.	Murray BE. Vancomycin-resistant enterococci. Am J Med. 1997; 102:284-293.

6.	French GL. Enterococci and vancomycin resistance. Clin infect Dis 1998; 7:75-83.

7.	Lerclercq R, Courvalin P. Resistance to glycopeptides in Enterococci. CID 1997; 24:545-556.

8.	Bascomb S, Manafı M. Use of enzyme tests in characterization and ıdentification of aerobic and facultatively anaerobic gram-positive cocci. Clın Mıcrobıol Rev 1998; 11: 318–340.

9.	Jett BD, Huycke MM, Gilmore MS: Virulence of enterococci. Clin Microbiol Rev 1994; 7: 462-78.

10.	 Lynn E. Hancock, Michael S. Gilmore. Pathogenicity of enterococci. in Fischettiet V(eds), Gram-Positive Pathogens, Washington DC: ASM, 2000.

11.	 Elsner HA, Sobottka I, Mack D, Claussen M, Laufs R, Wirth R. Virulence factors of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium blood culture isolates. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2000; 19(1):39-42.

12.	 Barza M. potential mechanisms of increased disease in human    from antimicrobial resistance in food animals. Mechanisms of increased disease CID 2002; 34(Suppl 3):126-130.

13.	 Jensen BG, Ahrens P, Dons L, Jones RN, Hammerum AM, Aaerestrup FM. Molecular analysis of Tn1546 in Enterococcus faecium isolated from animals and humans. J Clin Microbiol  1998; 36:437-442.

14.	 Kühn I, Iversen A, Burman LG, Olsson-Liljequist B, Franklin A, Finn M, Aarestrup F, Seyfarth A-M, Blanch AR, Taylor H, Caplin J, Moreno MA,  Dominguez L, Möllby R. Epidemiology and ecology of enterococci, with special reference to antibiotic resistant strains, in animals, humans and the environment example of an ongoing project within the European research programme. Int J Antimicrobial Agents 2000; 14: 337–342.

15.	 Söyletir G, Çerkçioğlu N: Streptokok infeksiyonları. Topçu AW, Söyletir G, Doganay M (eds): înfeksiyon Hastalıkları. İstanbul: Nobel Tıp Kilabevleri Ltd Şti,.1996:334.

16.	 Mollering RC. Enterococcus species,Streptococcus bovis and Leuconostoc species: Mandel GL, Bennet JE, Dalin R. Principles and practite of infectious disease. 4.edition. Churchill Liwingstone.1995 : 1826-1833.

17.	 Huycke MM, Sahm DF, Gilmore MS. Multiple-drug resistant enterococci: The nature of the problem and an agenda for the future. Emerg. Infect. Dis 1998; 4:239-249.

18.	 Topçu AW: Penisilinler: Topçu AW, Söyletir G, Doganay M (eds):înfeksiyon Hastalıkları . İstanbul: Nobel Tıp Kitabevleri Ltd.şti.. 1996 :130.

19.	 Chow WC. Aminoglycoside resistance in enterococci. CID 2000; 31: 586-589.

20.	 Şener S, Yıldırım M. Hayvanlarda antibiyotik kullanımı ve insan sağlığıyla ilgili sonuçları. ANKEM Derg 2002; 16:216-222

21.	 Tarım ve köyişleri Bakanlığı :Koruma kontrol genel Müdürlüğü 30.6.1999 tarihli tebliği.

22.	 Bilgehan H. Klinik mikrobiyolojik tanı. Barış Yayınları Fakülteler
Kitabevi, İzmir.1992.
23.	 Hindler J. Antimicrobial susceptibility testing. Isenberg HD, eds. Esential procedures for clinical microbiology. Washington : ASM 1998.

24.	 Butaye P, Devriese LA, Goossens H, Ieven M. Haesebrouck F. Enterococci with acquired vancomycin resistance in pigs and chickens of different age groups. Antimicrob Agents Chemother 1999; 43: 365–366.

25.	 Mc Ewen SA, Fedorka-Cray PJ. Antimicrobial use and resistance in animals. CID 2002; 34 (Suppl 3) :S93–106.

26.	 Gordts B, Landuyt H V, leven M, Vandamme P, Goossens H: Vancomycin-resistant enterococci colonizing the intestinal tract of hospitalized patients. J Clin Microbiol 1995; 32:2842-2846. 

27.	 Klein G, Pack A, Reuter G. Antibiotic resistance patterns of enterococci and occurence of vancomycin-resistant enterococci in raw minced beef and pork in Germany. Appl Environ Microbiol 1998; 64:1825-1830.

28.	 Van den Braak N, van Belkum A, van Keulen M, Vliegenthart J, Verbrugh HA, Endtz HP. Molecular characterization of vancomycin-resistant enterococci from hospitalized patients and poultry products in The Netherlands. J Clin Microbiol 1998; 36(7):1927-1932.

29.	 Robredo B, Singh KV, Baquero F, Murray BE, Torres C. Vancomycin- resistant enterococci isolated from animals and food. Int. J Food Microbiol 2000;54:197-204.

30.	 Yoshimura H, İshimaru M, Endoh YS.Isolation of glycopeptide-resistant enterococci from chicken in Japan. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42:3333.

31.	 Aarestrup, F. M., A. M. Seyfarth, H. D. Emborg, K. Pedersen, R. S. Hendriksen, and F. Bager. Effect of abolishment of the use of antimicrobial agents for growth promotion on occurrence of antimicrobial resistance in fecal enterococci from food animals in Denmark. Antimicrob. Agents Chemother 2001; 5: 2054-2059.

32.	 Coque TM, Tomayko JF, Ricke SC, Okyusen PC, Murray BE. Vancomycin-resistant enterococci from nosocomial comminity and animal sources in the United States. Antimicrob. Agents Chemother 1996; 40:2605-2609.

33.	 Padiglone A Grabsch EA, Olden D, Hellard M, Sinclair MI, Fairlay CK, Grayson ML. Fecal colonization vancomycin-resistant enterococci in Australia. Emerging infec Dis 2000; 6:534-536.

34.	 Singh-Naz N, Sleemi A, Pikis A, Patel KM, Campos JM. Vancomycin-resistant enterococcus faecium colonization in children.J clin Microbiol 1999; 37:413-416.

35.	 Bonten MJM, Hayden MK, Nathan C, Van Voorhis J, Mtushek M, Slaughter S, Rice T, Weinstein RA. Epidemiology of colonisation of patients and environment with vancomycin-resistant enterococci. Lancet 1996; 348:1615-1619.

36.	 Gambarotto K, Ploy M-C, Turlure P, Grélaud C, Martin C, Bordessoule D, Denis F. Prevalence of vancomycin-resistant enterococci in fecal samples from hospitalized patients and nonhospitalized controls in a cattle-rearing area of france. J. Clin. Microbiol 2000; 38: 620-6.

37.	 Stobberingh, E., A. van den Bogaard, N. London, C. Driessen, J. Top, and R. Willems. Enterococci with glycopeptide resistance in turkeys, turkey farmers, turkey slaughterers, and (sub)urban residents in the south of The Netherlands: evidence for transmission of vancomycin resistance from animals to humans? Antimicrob. Agents Chemother 1999; 43 : 2215-2221. 

38.	 Ieven M, Vercauteren E., Descheemaeker P, van Laer F, Goossens H. Comparison of direct plating and broth enrichment culture for the detection of ıntestinal colonization by glycopeptide-resistant enterococci among hospitalized patients. J. Clin. Microbiol 1999; 37: 1436-1440.

39.	 Vural T, Şekercioglu AS, Ögünç D, Gültekin M, Çolak D, Yeşilipek A, Ünal S, Kocagöz S, Mutlu G: Vankomisine dirençli Enterococcus
faecium suşu. ANKEM Derg 1999;13:1-4.

40.	 Yüce A, Karaman M, Gülay Z, Yulug N; Yenidoganlarda vankomisine dirençli enterokokların fekal taşıyıcılığı. ANKEM Derg 1999;13:7-11 

41.	 Ersoy Y. Malatya ve komşu illerde enterokok izolatları arasındaki glikopeptid direnci. Uzmanlık Tezi. İnönü Üni.Tıp Fak. Bakt. ve İnf. hast. AD. Malatya. 2000.

42.	 Moaddab SR, Töreci K. Enterokok suşlarında tür tayini, Vankomisin ve diğer bazı antibiyotiklere direnç aranması. Türk Mikrobiyol Cem Derg 2000; 30:77-84.

43.	 Gelişken Akgül S, Sümerkan B. Enterokok türlerinde vankomisin ve yüksek düzey aminoglikozid direncinin araştırılması. İnfeks Derg 1999;13(1): 67-70.

44.	 Van Horn KG,  Gedrıs CA,  Rodney KM. Selective isolation of Vancomycin-resistant enterococci. J Clin Microbiol 1996; 34:924-927.

45.	 Landman D, Quale JM, Oydna E, Willey B, Ditore V, Zaman M, Patel K, Saurina G, Huang W. Comparison of five selective media for identifying fecal carriage of vancomycin-resistant enterococci. J Clin Microbiol 1996; 34:751-75.

46.	 Weinstein JW, Tallapragada S, Farrel P , Dembry LM. Comparison of rectal and perirectal swabs for detection of colonization with vancomycin-resistant enterococci. J Clin Microbiol 1996; 34: 210-212.

47.	 Karadenizli A, Kolaylı F. Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesinde izole edilen enterokok türleri ve antibiyiotiklere duyarlılıkları. Türk Mikrobiyol Cem Derg 2002; 33:212-215.

48.	 Hoşgör M, Çavuşoğlu C, Tünger A, Özinel MA. Enterokoklarda yüksek düzey aminoglikozid direnci. İnfeks Derg  1997; 11(1);7-9.

49.	 Esen Ş, Sünbül M, Barut Ş, Eroğlu C, Saniç A, Leblebicioğlu H. Glikopeptid, beta-laktam ve aminoglikozid grubu antibiyotiklerin enterokoklara in-vitro etkinliği. ANKEM Derg 2001;15:59-63.

50.	 Öğünç D, Önküt G, Saygan MB, Çolak D, Gültekin M. Evalation of Various methods detection of high-level gentamicin resistance in enterococci. İnfeks Derg 2001; 15:83-86.

51.	 Çınar T, Leblebicioğlu H, Sünbül M, Eroğlu C, Esen Ş, Günaydın M. Enterokoklarda yüksek düzey gentamisin ve streptomisin direncinin araştırılması. Flora 1999; 4 :114-119.