Çipura (Sparus aurata L., 1758) beyin dibenzilfloresein o-debenzilaz enziminin karakterize edilmesi

Abstract

Aromataz, sitokrom P450 süper ailesinin üyesi olan CYP19 geni tarafından kodlanmakta ve androjenlerin ösrojenlere dönüşümünü katalizlemektedir. Doğal aromatazın katalitik aktivitesi ve enzim kinetikleri hakkında bilgi balıklarda çok azdır ve bu tür içi ve türler arasında farklı organlardan elde edilen aromataz aktivitesinin karşılaştırılmasını engellemektedir. Bu çalışmada, floresans aromataz metodu, florometrik bir substrat olan O-benzilfloresein benzil ester (DBF) kullanılarak çipura (Sparus aurata L., 1758) beyin ve karaciğer mikrozomlarında DBFOD aktivitesini ölçmek için karakterize edilmiştir. Optimize edilen metot değişkenleri, doku miktarı, pH, inkübasyon sıcaklığı, inkübasyon zamanı ve substrat konsantrasyonunu içermektedir. Beyin ve karaciğer DBFOD aktivitesi 30 dak reaksiyon zamanı boyunca sırasıyla 20 ?g ve 40 ?g protein miktarına kadar doğrusallık göstermiştir. Beyin ve karaciğerde enzimin optimum pH’sı sırasıyla 6,50 ve 8,25 olarak ve optimum sıcaklığı her iki doku için 30 °C olarak bulunmuştur. Beyin ve karaciğer DBFOD aktivitesinin 2 ?M DBF konsantrasyonu üzerinde doyuma ulaştığı gözlenmiştir. Lineweaver-Burk grafiği kullanılarak yapılan saptamalarda beyin ve karaciğer DBFOD enzimi için Vmax ve Km değerleri belirlendi ve sırasıyla 8,054±0,550 pmol/dak/mg protein, 8,389±0,543 pmol/dak/mg protein ve 0,840±0,161 ?M, 0,959±0,152 ?M olarak hesaplandı. Testosteronoun Sparus aurata beyin ve karaciğer DBFOD enzimini yarısmalı bir şekilde inhibe ettiği gözlenmiştir. Çeşitli yöresel Türk bitkisel gıdalarının DBFOD aktivitesi üzerine etkileri belirlenmiş ve bulgular bize bu gıdaların yeni aromataz inhibitörleri için potansiyel gıda kaynağı olabileceğini göstermiştir. Western blot analizleri anti-rat aromataz antikoru kullanılarak çalışılmıştır. Çipurada beyin ve karaciğer aromatazı için ilk defa rapor edilmiş bu metodun parametreleri diğer türlerde de aromataz aktivitesini ölçmek için faydalı olabilecektir.

Aromatase is encoded by the CYP19 gene, a member of the cytochrome P450 superfamily, and catalyzes the conversion of androgens into estrogens. Data on native aromatase enzyme kinetics and thus actual catalytic activity are scarce in fish, impeding comparison of aromatase activity (AA) from different organs within and between species. In the present study, fluorescence aromatase assay was optimized to measure DBFOD activity in the gilthead seabream (Sparus aurata L., 1758) using Obenzylfluorescein benzyl ester (DBF) as a fluorometric substrate in brain and liver microsomes. Optimized assay variables included amount of tissue, pH, incubation temperature, incubation time and substrate concentration. Brain and liver DBFOD activity have showed lineerity until 20 and 40 ?g protein concentration throughout 30 minutes, respectively. In brain and liver optimum pH of the enzyme have found to be 6.50 and 8.25, respectively and optimum temperature have found to be 30°C for both tissues. It has been observed that brain and liver enzyme activities have saturated at and above 2 ?M DBF concentrations. Vmax and Km values of brain and liver DBFOD enzyme was determined using Lineweaver-Burk graph, and calculated 8.054±0.550 pmol/min/mg protein, 8.389±0.543 pmol/min/mg protein and 0.840±0.161 ?M, 0.959±0.152 ?M, respectively. Testosterone appeared to inhibit the Sparus aurata brain and liver DBFOD enzyme competitively. The effects of a variety of Turkish traditional dietary plants on DBFOD activity was also determined and these results could lead us to identify the diets that could be potential dietary source for novel aromatase inhibitors. Western blot analysis performed using anti-rat aromatase antibodies. In conclusion, the parameters of this assay that are reported for brain and liver aromatase in gilthead seabream could be useful to measure aromatase activity in other species.