Limnodrilus profundicola (Verril 1871) kolinesteraz ve etoksirezorufin o-deetilaz aktivitelerinin biyomarkör olarak kullanılmasının araştırılması

Abstract

Bu çalışmada, Büyük Menderes Nehri’nin bir kolu olan Çürüksu Çayı üzerinde farklı istasyonlardan toplanan oligoket Limnodrilus profundicola’ların homojenizasyonuyla mikrozomal ve sitozolik fraksiyonlar elde edildi. L. profundicola’larda sitozolik kolinesteraz (ChE) karakterizasyonu, asetiltiyokolin (ATC), propiyoniltiyokolin (PTC) ve butiriltiyokolin (BTC) substratları kullanılarak gerçekleştirildi. ChE aktivitesi; asetilkolinesteraz (AChE), propiyonilkolinesteraz (PChE) ve butirilkolinesteraz (BChE) için sırasıyla 50 ?g, 50 ?g ve 100 ?g protein miktarına ve 150 saniye reaksiyon zamanına kadar lineerlik göstermiştir. Optimum pH ve sıcaklık her üç substrat için pH 8,5 ve 35 °C olarak bulunmuştur. AChE, PChE ve BChE için enzim aktivitesinin sırasıyla 7,5 ?M ATC, 5 ?M PTC ve 2,5 ?M BTC konsantrasyonu üzerinde sature olduğu gözlenmiştir. Lineweaver-Burk grafiği kullanılarak yapılan saptamalarda AChE, PChE ve BChE için Vmax ve Km değerleri sırasıyla 8636 U/dak/mg protein ve 1,202 mM; 6064 U/dak/mg protein ve 0,537 mM; 3065 U/dak/mg protein ve 0,560 mM olarak hesaplanmıştır. Yapılan çalışmalarda L. profundicola sitozolik ChE aktivitesi üzerine organofosfat, karbamat ve piretroid insektişitlerin etkisi incelenmiş ve insektisitlerin enzim aktivitelerini inhibe ettiği bulunmuştur. Bununla birlikte Çürüksu Çayı üzerinde belirlenen farklı istasyonlardan toplanan L. profundicola bireylerinde AChE aktiviteleri ölçülmüş ve farklılıklar bulunmuştur. Ayrıca, Sitokrom P4501A1 (CYP1A1) indüksiyonunu anlamak için EROD aktivitesi, 7-Etoksirezorufin substratı kullanılarak ölçülmüştür. CYP1A1 ve CYP4A ekspresyon düzeylerinin saptanması için Western blot analizleri, anti-Rat CYP1A1 ve CYP4A antikorları kullanılarak yapılmıştır. Sonuç olarak, bu çalışmada kirliliğe duyarsız olmayan ama dirençlilik kazanabilen, kirli ve temiz sularda yasayabilen kozmopolit bir tür olan L. profundicola’nın geniş çeşitlilikteki çevresel koşullara adaptasyonu ile kirlilik ve ekotoksikoloji çalışmalarında biyomarkör organizma olarak kullanılabilirliği gösterilmiştir.

In this study, oligochaete Limnodrilus profundicola collected from different sites along Curuksu stream on Menderes River were homogenized and microsomal and cytosolic fractions were prepared. Characterization of cytosolic cholinesterase (ChE) activities were carried out using acetylthiocholine (ATC), propionylthiocholine (PTC) and butyrylthiocholine (BTC) substrates. AChE, PChE and BChE activities were found to be linear with respect to 50, 50 and 100 ?g protein concentrations, respectively for 150 seconds incubation time . Optimum pH and temperature have found to be pH 8.5 and 35 °C for all substrate. It has been observed that AChE, PChE and BChE enzyme activities have saturated at and above 7.5 mM ATC, 5 mM PTC and 2.5 mM BTC concentrations, respectively. Apparent Vmax and Km values of AChE, PChE and BChE were determined using Lineweaver-Burk graph and calculated as 8636 U/min/mg proteins and 1,202 mM; 6064 U/min/mg proteins and 0,537 mM; 3065 U/min/mg proteins and 0,560 mM, respectively. In our studies, the effects of organophosphorous, carbamate and piretroid insecticides on L. profundicola cytosolic ChE activites were investigated and were found that these insecticides have inhibitory effects. AChE activities of L. profundicola collected from different stations of Curuksu Stream have measured and were observed to be different. In addition, for Cytochrome P4501A1 induction, EROD activity has been measured using 7-ethoxyresorufin as substrate. CYP1A1 and CYP4A expression levels were also determined by Western blot analysis using anti-Rat CYP1A1 and CYP4A antibodies. Consequently, L. profundicola which is a cosmopolitan organism with a reputation for being very resistant but not insensitive to pollution can adapt to a wide range of environmental conditions and our results suggests that L. profundicola can be used as a biomarker organism for organic pollution and ecotoxicological studies.