Kızılçam (Pinus brutia Ten.) sitokrom P450720B (CYP720b) geninin klonlanması ve karakterize edilmesi

Abstract

Kızılçam (Pinus brutia Ten.), ekonomik ve ekolojik bakımlardan Türkiye'nin önde gelen yerli orman ağaçlarındandır. Ağaçlandırma alanlarında karşılaşılan en büyük sorun böcek istilasıdır. Bu çalışmada Antalya ili Çığlık beldesinden toplanan ibre örneklerinden Bitki RNA İzolasyon Mini Kit ile elde edilen RNA'lardan cDNA sentezi RevertAid Revers Transkriptaz kullanılarak üretici firmanın talimatlarına göre gerçekleştirildi. Sentezlenen cDNA'lardan Pamukkale Üniversitesi Biyoloji Bölümü Moleküler Toksikoloji ve Biyokimya Araştırma Laboratuarımızda Pinus taeda CYP720B mRNA nükleotid dizisinden yola çıkarak sentezlettirilen primer dizileri kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirildi ve elde edilen sitokrom P450720B (CYP720B) geni pCR8/GW/TOPO klonlama vektörüne transfer edilerek rekombinant vektörler oluşturuldu ve TOP10 kompetan E. coli hücrelerine transforme edildi. Sekans analizi sonucunda Pinus brutia CYP720B (PbAO) geninin 1464 nükleotid ve 487 amino asit içerdiği ve Pinus taeda CYP720B (PtAO) geni ile %99 benzerlik gösterdiği bulundu. CYP720B gen bölgesi LR Klonaz enzimi kullanılarak pYES-DEST 52 maya ekspresyon vektörü'ne aktarıldı. Pinus brutia CYP720B'nin Saccharomyces cerevisiae transformantlarında ekspresyonu galaktoz ile indüklendi. 48 saat galaktoz indüklenmesi sonucunda western blot analizinde rekombinant CYP720B protein ekspresyonu gösterildi. Transformant Saccharomyces cerevisiae'da galaktoz indüklenmesi sonucunda elde edilen mikrozomal fraksiyonlarda CO-bağlı CYP720B'nin absorbans spektrumuna bakıldı ve maksimum 450 nm'de karakteristik pik yapan indirgenmiş CO-fark spektrumu elde edildi. Ayrıca çeşitli biyoinformatik analizler ile de gen hakkında detaylı bilgi edinildi.

Turkish red pine (Pinus brutia Ten.) is a prominent native forest tree species in Turkey, due to both its economic and ecological assets. One of the problems faced in afforestation sites is the attacks by insect. The material of this study is collected from a clonal seed orchard near Ciglik, Antalya. RNAs were isolated from needles using Plant RNA Isolation Mini Kit and then cDNA was synthesized using RevertAid Reverse Transcriptase. Polymerase chain reaction was performed using gene specific degenerative primers which had been designed based on the Pinus taeda CYP720B mRNA nucleotid sequence and all the experimental and practical procedures are being carried out in Pamukkale University, Department of Biology, Molecular Toxicology and Biochemistry Laboratory. PCR product of Pinus brutia CYP720B gene was cloned into the pCR8/GW/TOPO cloning vector and transformed into TOP10 competent E.coli cells. After sequence analysis, Pinus brutia CYP720B (PbAO) gene was found to be 1,464 nucleotide long, coding 487 amino acids and shared 99% similarly with Pinus taeda CYP720B (PtAO) gene. PbAO was also transferred to a yeast expression vector pYES-DEST52 with the use of LR Clonase enzyme. Expression of Pinus brutia CYP720B in Saccharomyces cerevisiae transformants was induced by galactose. After 48 hour of galactose induction recombinant CYP720B protein expression was identified by western blot analysis. Furthermore, CYP720B exhibited a characteristic reduced CO-difference spectrum at 450 nm. Also, detailed gene information was obtained through bioinformatic analysis.