Pseudomonas cinsi bakterilerde hekzavalent krom indirgeme üzerine organik moleküllerin etkisi

Abstract

Bu çalışmada 16S rRNA sekans analizi sonuçlarına göre toplam 12 izolat içerisinde 5 farklı türün mevcut olduğu tespit edilmiştir. Bu izolatların 3'ü Enterobacter cancerogenus, 4'ü Pseudomonas mendocina, 1'i Exiuguobacterium aurantiacum, 2'si Pseudomonas stutzeri ve 2'si Enterobacter cloacae olarak kaydedilmiştir. Bakterilerin krom dirençliliği, Minimum İnhibisyon Konsantrasyonuna (MİK) göre belirlenmiştir. Krom indirgeme deneyleri P. mendocina PASS3-P18 (110 mg/L) ve P. mendocina DS0601-FX-P22 (25 mg/L) suşları ile yapılmıştır. P. mendocina PASS3-P18 ve P. mendocina DS0601-FX-P22 suşlarında krom indirgemeyi etkileyen şartlar optimize edilmiştir. Her iki bakterinin optimal gelişme sıcaklıkları 37 ºC olarak belirlenmiş ve tüm krom indirgeme deneyleri Triptik Soy Broth (TSB) besiyerinde yapılmıştır. Bu çalışmada pH, farklı krom konsantrasyonları ve elektron kaynağı olarak aljinik asit, galakturonik asit, glukuronik asit ve sitrik asit gibi organik asitlerin ve bunların ikili kombinasyonlarının bakteriyel krom indirgemesi üzerine etkileri araştırılmıştır. Ayrıca her iki bakteri için biyosorpsiyon çalışmaları da yapılmıştır. Başlangıç krom konsantrasyonun etkisinin belirlenmesinde, P. mendocina PASS3-P18 suşu için 110, 80, 50 ve 30 ppm, P. mendocina DS0601-FX-P22 bakterisi için 25, 20, 15 ve 10 ppm Cr (VI) konsantrasyonları kullanılmıştır. Krom indirgeme, difenil karbazid metoduna göre yapılmıştır. Çalışma sonunda elde edilen verilere göre , bakterilerin en iyi indirgeme yaptıkları pH dereceleri P. mendocina PASS3-P18 suşu için pH 7.0 ve P. mendocina DS0601-FX-P22 suşu için pH 6.0 olarak kaydedilmiştir. P18 suşu için krom indirgeme süreleri açısından 110 ve 80 ppm krom konsantrasyonları arasında bir fark gözlenmezken, krom miktarı 50 ve 30 ppm'de krom indirgeme süresi azalmıştır. 110 ve 80 ppm krom kullanıldığında 168 saat süren krom indirgeme süresi, 50 ppm için 84 saate ve 30 ppm için 60 saate düşmüştür. P22 suşu için ise kullanılan krom konsantrasyonları arasında bir fark bulunmayıp, bütün krom konsantrasyonlarında krom indirgemesi 36 saat sürmüştür. Organik asitlerin krom indirgemesi üzerine etkisine bakılacak olursa, P18 suşu için genel olarak kullanılan tüm krom konsantrasyonlarında galakturonik ve glukuronik asit kullanıldığında krom indirgeme süreleri önemli derecede azalmıştır. Aljinik asit tüm krom konsantrasyonlarında krom indirgemesinde hiçbir etki göstermemiştir. P22 suşu açısından, genel olarak kullanılan tüm krom konsantrasyonlarında galakturonik ve glukuronik asit krom indirgeme sürelerini azaltmışlardır. Fakat hem sitrik asit hem de aljinik asit bu bakteri için krom indirgemesi üzerine etki etmemiştir. Organik asitlerin ikili kombinasyonlarının krom indirgemesi üzerine olan etkileri incelendiğinde her iki bakteri için de galakturonik ve glukuronik asitin birbirleriyle ve diğer organik asitlerle kombinasyonlarının olumlu etkisi tespit edilmiştir. Biyosorbsiyon deneylerinde her iki bakterinin de hücre yüzeyinde kromu tutmadığı görülmüştür. Bu sonuç, çalışmamızda kullanılan bakterilerin kromu indirgediğine dair bir kanıt niteliğindedir. Pseudomonas mendocina PASS3-P18 için yapılan scanning elektron mikroskop görüntülerinde kromlu ve kromsuz ortamdaki hücreler karşılaştırıldığı zamanla kromlu ortamdaki hücrelerin dejenere olmuş yapıları net bir biçimde farkedilebilmektedir.SDS-PAGE analizi sonucunda ise P. mendocina DS0601-FX-P22 suşunda 31 kDa civarında bir protein bandı, P. mendocina PASS3-P18 de ise iki ayrı protein bandının indüklendiği gözlenmiştir. Bu protein bantlarından biri yaklaşık olarak 29 kDa büyüklüğünde iken diğer bandın moleküler büyüklüğü yaklaşık olarak 52 kDa'dur.

In this study, as a result of the 16S rRNA sequence analysis, 5 different types of bacteria out of a total of 12 isolates were found. Three of them are Enterobacter cancerogenus, four of them are Pseudomonas mendocina, one of them is Exiuguobacterium aurantiacum, two of them are Pseudomonas stutzeri, another two are Enterobacter cloacae. The chromium resistance of bacteria was determined by Minimum Inhibition Concentration (MIC). The chromium reduction experiments were done by P. mendocina PASS3-P18 (110 mg/L) strain and P. mendocina DS0601-FX-P22 strain (25 mg/L). For the selected strains P. mendocina PASS3-P18 and P. mendocina DS0601-FX-P22, the effect of conditions on chromium reduction were optimized. For both of the bacteria, the optimal temperature was determined at 37 ºC and the chromium reduction were conducted in Triptic Soy Broth (TSB) medium. In this study, the effects of the pH, chromium concentrations, and organic acids such as alginic acid, galacturonic acid, glucuronic acid, and citric acid, and their binary combinations on the bacterial chromium reduction were investigated. Biosorption were also done for both bacterial strains. For the effect of initial chromium concentrations; 110, 80, 50 and 30 ppm were used for P. mendocina PASS3-P18 and 25, 20, 15 ve 10 ppm for P. mendocina DS0601-FX-P22, respectively. Chromium reduction were conducted diphenylcarbazide method. According to the findings that were obtained at the end of the study, the best pH degree in which the bacteria indicated high reduction degree for P. mendocina PASS3-P18 strain was 7.0 while it was 6.0 for P. mendocina DS0601-FX-P22. The chromium reduction times decreased for 50 ppm and 30 ppm of chromium concentrations while there was no difference between 110 ppm and 80 ppm of chromium concentrations for P18 strain. While the reduction time was 168 h in 110 and 80 ppm, it was 84 h and 60 hours in 50 and 30 ppm, respectively. Regarding the effects of the organic acids used in the study; generally, the times of chromium reduction decreased significantly in all the chromium concentrations, when galacturonic acid and glucuronic acid were utilized by the P18 strain. Alginic acid did not have any effect in all chromium concentrations on the bacterial chromium reduction. In general, the chromium reduction times decreased significantly in all chromium concentrations, when galacturonic acid and glucuronic acid were utilized. The citric acid and alginic acid have not efected on the bacterial chromium reduction. Regarding the effects of binary combinations of organic acids on the bacterial chromium reduction; the combinations of galacturonic and glucuronic acids with each other and other organic acids have positive effect for both strains. In the biosorption experiments conducted for both of the P18 and the P22 strains, it was seen that the bacteria did not keep chrome on the surface of cell. This result of the present study is evidence that the strains reduced chromium. Upon analyzing the scanning electron microscope, when we compared the media with and without chromium, we observed that the cells degenerated in presence chromium for Pseudomonas mendocina PASS3-P18..As a result of SDS-PAGE analysis, it was observed a protein band approximately 31 kDa in P. mendocina DS0601-FX-P22. In P. mendocina PASS3-P18, two different protein bands were found. One of protein bands was approximately 29 kDa and the other one was approximately 52 kDa.