Tarhana hamuru fermantasyonunun mikrobiyal taksonomik yapısının ve populasyon dinamiğinin belirlenmesi

Abstract

Tarhana, Türkiye'de yaygın olarak tüketilen ve buğday unu, yoğurt, çeşitli sebzeler ile baharatların ilavesiyle hazırlanan hamurun fermente edildikten sonra kurutulup öğütülmesi ile elde edilen geleneksel bir fermente gıdadır. Bu çalışmada, daha önce ayrıntılı olarak belirlenmemiş olan tarhana fermantasyonu florasının aydınlatılması amacı ile önemli miktarda ev ve endüstriyel ölçekli üretim yapılan Uşak yöresinde bulunan evlerden (A, B,C, D ve E) ve yerel işletmelerden (F, G, H ve K) toplanan tarhana hamurlarının fermantasyon süresi boyunca taksonomik yapısı ve populasyon dinamiği belirlenmiştir. Eş zamanlı olarak genel mikrobiyolojik ve kimyasal özellikleri de belirlenmiştir. Elde edilen genel mikrobiyolojik ve kimyasal verilerin ev ve işletme tipi örneklerin karşılaştırma sonucu: ev tipi tarhana hamurlarının LAB ve maya sayısının işletme tipi tarhana hamurlarına kıyasla daha düşük; koliform ve S. aureus sayılarının ise daha yüksek bulunduğu saptanmıştır. Temel kimyasal özellikleri bakımdan değerlendirildiğinde: ev tipi tarhana hamurlarının işletme tipi tarhana hamurlarına göre pH değerlerinin daha düşük, asitlik sayılarının daha yüksek olduğu; yine % kuru madde değerinin de ev tipi tarhana hamurlarında daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Fermantasyon süresi boyunca ev tipi ve işletme tipi tarhana hamurlarının LAB ve maya mikroflorasının çeşitliliğinin ve değişiminin belirlenmesi için kültüre bağlı ve kültürden bağımsız yöntemler kullanılmıştır. 54 farklı tarhana hamurundan (A, B, C, D, E, F, G, H ve K örnekleri, 6 farklı fermantasyon günü) toplam 2000 adet LAB ve 2000 adet maya izole edilmiştir. LAB tür çeşitliliğinin ve değişiminin belirlenmesi için kültüre bağlı yöntemlerden (GTG)5 parmak-izi analizi ile 16S rDNA ve pheS DNA dizi analizi kullanılmıştır. Toplanan LAB izolatları, (GTG)5 parmak-izi dizi analizi ile 43 farklı grupta sınıflandırılmıştır. Her gruptan bir adet alınarak elde edilen toplam 43 farklı LAB izolatının 16S rDNA ve pheS DNA dizi analizi ile tanımlanması sonucunda Lactobacillus plantarum (16), Lactobacillus brevis (7), Leuconostoc mesenteriodes (2), Leuconostoc pseudomesenteriodes (1), Pediococcus acidilactici (1), Lactococcus lactis (3), Lactobacillus fobifermentas (1), Lactobacillus mindensis (1), Lactobacillus paralimentarius (1), Lactobacillus alimentarius (1), Lactobacillus namurensis (3), Lactobacillus casei (1), Lactobacillus pentosus (1), Lactobacillus farciminis (3), Leuconostoc citreum (1) türlerinden oluştuğu belirlenmiştir. Maya tür çeşitliliğinin ve değişiminin belirlenmesinde de kültüre bağlı yöntemlerden M13 parmak-izi analizi, 5,8S rDNA ve 28S rDNA dizi analizi kullanılmıştır. Maya izolatları, M13 parmak-izi analizi sonuçlarına göre 46 farklı gruba ayrılmıştır. Gruplardan seçilen maya izolatlarının tanımlanması için uygulanan 5,8S rDNA ve 28S rDNA dizi analizi sonucunda, maya türlerini Candida glabrata (11), Candida humilis (10), Issatchenkia orientalis (9), Saccharomyces cerevisia (7), Kluyveromyces marxianus (4), Pichia kudriavzevii (2), Saccharomyces servazzi (1), Torulaspora delbrueckii strain (1) ve GM6 (1) suşlarının oluşturduğu belirlenmiştir. Tarhana hamurlarında bulunan LAB ve maya türlerini kültürden bağımsız olarak tanımlamak ve fermantasyon sürecinde mikrobiyal florada meydana gelen değişimi belirlemek için Polimeraz Zincir Reaksiyonu ve Denature Gradiyent Jel Elektroforezi (PZR-DGGE) yöntemi kullanılmıştır. Çalışmada PZR-DGGE ile kültüre bağlı yöntemlerden farklı laktobasil ve maya türleri tespit edilmiştir. Bu farklı LAB türleri ev tipi tarhana hamurlarında Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus acidophilus ve Streptococcus thermophilus; işletme tipi tarhana hamurlarında ise Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Pediococcus pentosaceus olarak; farklı maya türleri ise ev tipi tarhana hamurlarında Saccharomyces barnettii ve Kazachstania unispora olarak belirlenmiştir. Tarhana hamurlarında tüm fermantasyon süresince baskın olan LAB türlerinin Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ve Streptococcus thermophilus; maya türlerinin Saccharomyces cerevisiae, Candida humilis, Issatchenkia orientalis ve Candida glabrata olduğu belirlenmiştir. Tüm bu veriler, tarhana hamurlarının çok zengin bir LAB ve maya florasına sahip olduklarını, izolasyonda zenginleştirilmiş ve birden fazla besiyeri kullanımının genel florayı yansıtmada daha başarılı olacağını ve kültüre bağımlı yöntemler ile kültürden bağımsız yöntemlerin bir arada kullanılarak polifazik bir yaklaşımda bulunulmasının daha iyi tür tespiti sağlayacağını ortaya koymuştur.

Tarhana is a traditional fermented food, consumed widely in Turkey, obtained by grinding and drying of fermented dough that is prepared with wheat flour, yoghurt, various vegetables and spices. In this study, with the purpose to elucidate the fermentation flora of tarhana which was not specified as in detail previously, the population dynamic and taxonomic structure of tarhana doughs collected from houses (A, B, C, D and E) and local factories (F, G, H and K) in Uşak region where the tarhana has been produced at household and industrial-scale in a significant amount, were determined during fermentation period of tarhana doughs. At the same time general microbiological and chemical properties of tarhana doughs were specified. The counts of lactic acid bacteria (LAB) and yeast of house-type tarhana doughs were found lower than the factory-type tarhana doughs; on the other hand their coliform and S. aureus counts were higher than factory-type tarhana doughs. In terms of the basic chemical properties, house-type tarhana doughs had lower pH values, higher acidity counts and dry matter then the factory-type tarhana doughs The culture dependent and culture independent molecular methods were performed for the determination of change and diversity of the LAB and yeast microflora during the fermentation period. A total of 2000 LAB and 2000 yeast were isolated from fifty four different tarhana doughs (A, B, C, D, E, F, G, H and K samples for six fermentation periods). (GTG)5 fingerprint analysis, 16S rDNA sequence analysis and pheS DNA sequence analysis of culture dependent methods were used to determine the change and diversity of LAB. LAB isolates were classified in 43 different groups with (GTG)5 fingerprint analysis and samples obtained from each group, were identified with 16S rDNA and pheS DNA sequence analysis. According to identification results, LAB species were determined as Lactobacillus plantarum (16), Lactobacillus brevis (7), Leuconostoc mesenteriodes (2), Leuconostoc pseudomesenteriodes (1), Pediococcus acidilactici (1), Lactococcus lactis (3), Lactobacillus fobifermentas (1), Lactobacillus mindensis (1), Lactobacillus paralimentarius (1), Lactobacillus alimentarius (1), Lactobacillus namurensis (3), Lactobacillus casei (1), Lactobacillus pentosus (1), Lactobacillus farciminis (3), Leuconostoc citreum (1). M13 fingerprint analysis, 5,8S rDNA sequence analysis and 28S rDNA sequence analysis of culture dependent methods were used to determine the change and diversity of yeast species. According to results of M13 fingerprint analysis, yeast isolates were divided 46 groups. As a result of 5,8 rDNA and 28S rDNA sequence analyses that were made for identification of yeast isolates that were selected from groups, yeast species were specified as Candida glabrata (11), Candida humilis (10), Issatchenkia orientalis (9), Saccharomyces cerevisia (7), Kluyveromyces marxianus (4), Pichia kudriavzevii (2), Saccharomyces servazzi (1), Torulaspora delbrueckii strain (1) and GM6 (1). Polymerase Chain Reaction and Denature Gradient Gel Electrophoresis (PCR-DGGE) were used to identify of LAB and yeast species as independently culture in tarhana doughs and determine microflora changes in during all fermentation period. The different lactobacilli and yeast species were found with PZR-DGGE as compared to culture dependent methods. The LAB species were identified as Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus acidophilus and Streptococcus thermophilus in house-type tarhana doughs, and as Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum and Leuconostoc pseudomesenteroides in factory-type tarhana doughs, and also yeast species were identified as Saccharomyces barnettii and Kazachstania unispora in house-type tarhana doughs. The dominant LAB species in tarhana doughs during fermentation period were specified to be Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus. And Saccharomyces cerevisiae, Candida humilis, Issatchenkia orientalis and Candida glabrata were determined as dominant yeast species. All of these data revealed that tarhana doughs have a very rich flora of LAB and yeast, enriched and using more than one medium in isolation could be more successful to reflect general microflora, and polyphasic approach would provide better determination of species by using a combination of culture independent and culture dependent methods.