Laktik asit bakterileri tarafından üretilen patojene spesifik bakteriyosinlerin karakterizasyonu ve kokteyl olarak kullanımı

Abstract

Gıda sistemlerinde patojen bakteriler üzerine antibakteriyel etkili bakteriyosinler önemli doğal koruyuculardan birisidir. Ancak bakteriyosinlerin sınırlı antibakteriyel spektrumları nedeniyle gıda sistemlerinde mutlak güvenlik sağlanamamaktadır. Bu çalışmada gıda sistemlerinde sorun oluşturan patojen bakterilere spesifik antibakteriyel etkili bakteriyosin üreticileri izole edilerek karakterize edilmiş ve bu patojen-spesifik bakteriyosinlerden (PSB) oluşturulan kokteylin süt ortamında patojen bakteriler üzerine etkisi gösterilmiştir. 250 farklı gıda örneğinden PSB üreticileri, her bir patojenin (Bacillus cereus, Listeria monocytogenes ve Staphylococcus aureus) 5 farklı suşunun karışımına (5x105 kob/ml) karşı antibakteriyel etkisi belirlenerek izole edilmiştir. Bu stratejiye göre denenen 50 adet B. cereus, 10 adet L. monocytogenes ve 10 adet S. aureus suşlarının tümü üzerinde inhibisiyon etkisi bulunan üç farklı izolat elde edilmiş, bunların 7 adet laktik asit bakterisi (LAB) suşlarına karşı antibakteriyel etkisi bulunmamıştır. 16S rDNA dizi analizine göre üç izolatın sırasıyla Lactobacillus plantarum PFC339, Enterococcus faecalis PFC340 ve Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis PFC341 türleri olduğu (%99,86, %100 ve %100 homoloji) belirlenmiştir. Bu üretici suşlardan PSB’ler, biyoreaktör ortamında üretildikten sonra amonyum sülfat çöktürmesi, katı-faz ekstraksiyonu ve UHPLC sistemleri kullanılarak saflaştırılmış, spesifik aktiviteleri sırasıyla 607,59, 1472,39 ve 297,03 AU/mg olarak ölçülmüştür. PSB’lerin antibakteriyel aktivitesi proteolitik enzimler ile muamele edildiğinde kaybolmuştur. Ayrıca PBS’lerin MALDI-TOF ile sırasıyla, 1219.021, 3346.803 ve 4853.768 Da moleküler büyüklüğe sahip oldukları tespit edilmiştir. FE-SEM, PSB’lerin patojenlerin hücre duvar yapısı üzerinde farklı şekilde etkili olduğunu ve hücre duvar geçirgenliğini bozarak veya porlar oluşturarak inhibe ettiğini göstermiştir. Süt ortamına 100 AU/ml ilave edilen PSB’ler etkili olduğu patojenlerin sayısını azaltırken, diğer iki patojen üzerinde etkisi bulunmamıştır. Ancak PSB’lerin kokteyl halinde kullanılması durumunda her üç patojenin de süt ortamında gelişimi durdurulabilmiştir. Sonuç olarak bu çalışmada sadece B. cereus, L. monocytogenes ve S. aureus türlerine spesifik etkili üç farklı bakteriyosin üreticisi izole edilmiş ve bu bakteriyosinlerin gıda sistemlerinde kokteyl şeklinde ilk defa kullanılması ile patojenlerin engellenebileceği gösterilmiştir.

In food systems, bacteriocins with antibacterial effect on pathogenic bacteria are one of the important natural preservatives. However, due to the limited antibacterial spectra of bacteriocins, absolute safety cannot be achieved in food systems. In this study, bacteriocin producers with specific antibacterial effects against pathogenic bacteria that cause problems in food systems were isolated and identified and the performances of the cocktail formed from these pathogen-specific bacteriocins (PSBs) on the pathogenic bacteria in the milk were determined. From 250 different food samples, PSB producers were isolated by determining the antibacterial effect against a mixture of each pathogens (Bacillus cereus, Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus) of 5 different strains (5x105 cfu / ml). According to this strategy, three different isolates were obtained with the inhibition effect on all 50 strains of B. cereus, 10 of L. onocytogenes and 10 of S. aureus strains and they did not have any antibacterial effect against 7 strains of lactic acid bacteria (LAB). According to the 16S rDNA sequence analysis, three isolates were identified as Lactobacillus plantarum PFC339, Enterococcus faecalis PFC340 and Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis PFC341 species (99,86 %, 100 % and 100 % homology). The PSBs were purified using ammonium sulfate precipitation, solid-phase extraction, and UHPLC systems after they were produced in a bioreactor and the specific activities were measured as 607,59, 1472,39 and 297,03 AU / mg, respectively. The antibacterial activity of PSBs was lost when treated with proteolytic enzymes. In addition, PBSs were found to have a molecular size of 1219.021, 3346.803 and 4853.768 Da by MALDI-TOF, respectively. FE-SEM showed that PSBs were distinctly effective on the cell wall structure of pathogens by inhibiting cell wall permeability or by forming pores. PSBs added 100 AU/ml to the milk, reduced the number of pathogens to which it was effective while they had no effect on the other two pathogens. However, when the PSBs were used as cocktails, the growth of all three pathogens in the milk medium could be stopped. In conclusion, in this study, three different bacteriocin producer was isolated with only specific activity to B. cereus, L. monocytogenes and S. aureus species and pathogens were shown to be prevented by using these bacteriocins within cocktails in food systems for first time.