Mitokondriyal miRNA’ların (mitomir) meme kanseri hücre hatlarında araştırılması

Abstract

Kadınlarda en sık görülen meme kanseri %5 genetik yatkınlıkla ilişkilidir ve otozomal dominant kalıtımlıdır. Mitokondri; metabolizma, hücre ölümü ve inflamasyon gibi önemli hücresel olaylarda rol almaktadır. Bu hücresel olayların basamaklarında, küçük RNA’ların (sRNA), özellikle miRNA’ların önemli rol oynadıkları mRNA ve protein seviyelerini kontrol ettikleri bilinmektedir. Son yıllarda yapılan çalışmalar olgun miRNA’ların yanı sıra pre-miRNA’ların da mitokondride yer aldıklarını ve proteinlerin bölgeye özgü regülasyonlarını belirlemede mitokondrinin önemini vurgulamaktadır. Bu çalışmada meme kanseri hücre hatlarında, mitokondriyal miRNA’ların muhtemel rollerinin belirlenmesi amaçlandı.Araştırmada, MCF-10A, MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hatlarından ‘Magnetic Activated Cell Sorting (MACS)’ yöntemi ile mitokondriyal fraksiyonlar hazırlandı. Bu fraksiyonlar RNAse A ile yıkanarak sitozolik kontaminasyonun uzaklaştırılması sağlandı. Mitokondriyal DNA tarafından kodlanan genlerin ekspresyonlarının değerlendirildiği mtRNA örneklerinde ekspresyon değişimleri qRT-PCR ve yeni nesil dizileme yöntemleri ile teyit edildi. Küçük RNA dizileme analizi sonucu belirlediğimiz miRNA’ların fonksiyonlarını analiz etmek amacıyla web tabanlı DIANA biyoinformatik analiz programı kullanıldı ve anlamlı bulunan miRNA’ların hangi biyolojik süreç, moleküler işlev ve biyokimyasal yolakta yer aldığını belirlemek için Gen Ontoloji (GO) ve Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) yolak analizleri Fischer’s exact testi metoduyla değerlendirildi. Mitokondriyal genom tarafından kodlanan miRNA’ların mitokondriyal genomdaki pozisyonları SerialCloner 2-6-1 programı kullanılarak belirlendi. Araştırmada, mitokondri ile ilişkili en sık belirlenen miRNA hsa-miR-6087-5p, hsa-miR-3960-3p, hsamiR-7641-5p, hsa-miR-3648-3p, hsa-miR-4488-5p, hsa-miR-4485-5p, hsa-miR-44493p, hsa-miR-4484, let-7 ailesi üyeleri (let-7a,b,c,d,e,f,g,i), hsa-miR-1290-3p, hsa-miR423-5p olmakla birlikte miR-221-3p, miR-92a-3p, hsa-miR-1246-5p, hsa-miR-1275-5p, hsa-miR-663a-5p, miR-25-3p, miR-23a-3p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-320a-3p’da mitokondri ile ilişkili bulundu. Analiz sonucuna göre; hsa-miR-4461, hsa-miR-4484 ve hsa-miR-4485’nın mitokondriyal genom tarafından sırasıyla ND4L, L-ORF ve 16S rRNA genleri ile homoloji gösteren ve mitokondriyal genomdaki pozisyonlarının (10689–10711) , (5747–5763) ve (2539–2554) olduğu belirlendi. Tanımlı miRNA’ların yanısıra ilk kez mitokondriyal gen bölgeleri ile homoloji gösteren novel miRNA dizileri de saptandı. Mitokondride lokalize olan veya ilişkili olan miRNA’ların insan sağlığı ve hastalıklar üzerine etkilerinin ve biyolojik önemlerinin aydınlatılabilmesi için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.

Breast cancer which is the most common cancer type among women have an autosomal dominant inheritance pattern, as well as 5% of them are being associated with genetic predisposition. The cellular processes are controlled at mRNA and proteins levels in mitochondria, where small RNAs (sRNAs) especially miRNAs play critical roles. The recent studies have led the understanding that mitochondria are one of the destinations of pre-miRNAs besides mature miRNAs. The newly destination of miRNAs suggest the role of mitochondria in following-up site specific regulations of proteins as well as the function of mitochondria. In this study we aimed to identify possible roles of mitochondrial miRNAs in breast cancer cell lines. Therefore, mitochondrial fractions were prepared from MCF-10A, MCF-7 and MDA-MB-231 cells by using ‘Magnetic Activated Cell Sorting (MACS)’ methodology. Fractions were treated with RNase A in order to remove cytosolic contaminants. In mtRNA samples expression changes were evaluated both qRT-PCR and next generation sequencing. As a result of small RNA sequencing, in order to identify the functions of miRNAs, a web based tool was used. Gene ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analysis were evalutated by Fisher’s exact test method. Genomic positions of mitochondrial encoded miRNAs were detected by using SerialCloner 2-6-1 programme. hsa-miR-6087-5p, hsa-miR-3960-3p, hsa-miR-7641-5p, hsa-miR-3648-3p, hsa-miR-4488-5p, hsa-miR-4485-5p, hsa-miR-4449-3p, hsa-miR4484, let-7 family members, hsa-miR-1290-3p and hsa-miR-423-5p was found to be most relevant with mitochondria as well as miR-221-3p, miR-92a-3p, hsa-miR-1246-5p, hsa-miR-1275-5p, hsa-miR-663a-5p, miR-25-3p, miR-23a-3p, hsa-miR-423-5p, hsamiR-320a-3p. hsa-miR-4461, hsa-miR-4484 and hsa-miR-4485 aligned to mitochondrial genome at positions (10689–10711), (5747–5763) and (2539–2554) corresponding to ND4L, L-ORF and 16S rRNA genes respectively. In this study besides known miRNAs, novel miRNAs which are shown to have homology with mitochondrial genes were also identified. Further studies are required for enlighting the biological importance and effects on human heealth of mitochondrialocalized or related miRNAs.