Trehaloz'un dondurulmuş çözdürülmüş koç spermleri ince yapısı üzerine kriyoprotektif etkisinin araştırılması

Abstract

Türlerin genetik korunmaları için yapılan sperm kriyoprezervasyonu işlemlerinde, hücrelerde ince yapı düzeyinde kriyohasarlar meydana gelir. Kriyoprotektanların, spermatozoa kriyohasarlarına karşı koruyucu etkileri olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada, trehalozun dondurulmuş-çözdürülmüş koç spermleri üzerine kriyoprotektif etkileri ince yapı düzeyinde araştırılmıştır. Bu amaçla, Merinos koçlarından toplanan ejakülatlar karıştırılmış ve 37 0C'de değerlendirilmiştir. Karıştırılmış semen örnekleri altı kısma bölünmüştür. Daha sonra, %5 gliserol, %3 gliserol + 60 mM trehaloz, %1,5 gliserol + 100 mM trehaloz, %5 etilen glikol, %3 etilen glikol + 60 mM trehaloz ve % 1,5 etilen glikol + 100 mM trehaloz grupları temel tris sulandırıcısıyla sulandırılarak 5 0C'de soğutulmuş ve daha sonra 0.25 ml'lik payetlerde sıvı azot içinde saklanmıştır. Elektron mikroskopisi için örnekler, 37 0C'de çözdürülmüş ve sulandırıcılarını uzaklaştırmak için santrifüj edilmiştir. Karnovsky fiksatifinde tespit edilen örneklerin osmiyumtetroksit ile ikinci tepit işlemi yapılmıştır. Daha sonra, dereceli alkol serilerinden geçirilen örnekler, propilen oksit ile muamele edilerek Araldite gömülmüşlerdir. Yarı ince kesitler Toluidin Mavi’si (TB) ile boyanmış ve ışık mikroskobunda incelenmiştir. Negatif boyanmış ince kesitler Alan Emisyon Taramalı Elektron Mikroskobunun (FESEM, Carl Zeiss, Supra 40 VP) STEM dedektörü ile incelenmiştir. Tüm gruplarda, spermlerde membran deformasyonları, vakuolizasyon, yapısal genişlemeler, aksonem ve mitokondri hasarları, çift kuyruk, ince yapı düzeyinde ayırt edilmiştir. Elektron mikroskobunda gözlenen sperm ince yapı değişikliklerine göre yapılan istatiksel analizde, en az hasarın % 5 etilen glikol ve % 1,5 etilen glikol + 100 mM trehaloz içeren gruplarda olduğu belirlenmiştir. Sonuç olarak, kriyoprezervasyonun spermlerde ince yapı hasarlarına yol açtığı, %1,5 etilen glikol/100 mM trehaloz karışımının sperm kriyohasarını aza indirgeyerek kriyoprotektif etki sağladığı ileri sürülebilir.

In the sperma cryopreservation processes applied for genetic conservation of species, ultrastructural cryodamages occur in the cells. It has been known that cryoprotectants have protective effects against cryodamages of spermatozoa. İn this study, the cryoprotective effects of trehalose on frozen-thawed ram spermatozoa were investigated at the ultrastructural level. For this purpose, ejaculates collected from Merino rams were pooled and evaluated at 37 °C. Pooled semen samples were divided into six parts. Then, they were diluted with a Tris-based extender containing additives including % 5 glycerol, % 3 glycerol + 60 mM trehalose, % 1,5 glycerol + 100 mM trehalose, % 5 ethylene glycol, % 3 ethylene glycol + 60 mM trehaloz, % 1,5 ethylene glycol + 100 mM trehalose. Then, they all were cooled to 5 °C and then frozen in 0.25 ml French straws in liquid nitrogen. Samples were thawed at 37 OC and centrifuged to remove the diluents for electron microscopy. Samples were fixed in Karnovsky's fixative and then post-fixed with osmiumtetroxide. Then, samples were dehydrated in graded ethanol series, treated in propylene oxide and embedded in Araldite. Semithin sections were stained with Toluidin Blue (TB) and examined with light microscope. Negatively stained ultrathin sections were examined with by STEM detector of Field Emission Scanning Electron Microscope (FESEM, Carl Zeiss, Supra 40 VP). In all groups, membrane deformations, vacuolization, structural expansions, axonem, mitochondria damages and double tail in spermatozoa were ultrastructurally distinguished. In the statistical analyses performed according to ultrastructural damages of spermatozoa observed by electron microscopy, the least damages were determined in the groups of containing %5 ethylene glycol and %1,5 ethylene glycol + 100 mM trehalose. As a result, it can be suggested that cryopreservation causes ultrastructural damages in spermatozoa and 1,5% ethylene glycol/100 mM trehalose mixture provide a cryoprotective effect by reducing the sperm cryodamages.