Parkinson hastalığında uzun kodlamayan RNA (lncrna) profillerinin araştırılması

Abstract

Parkinson hastalığı (PH), Substantia Nigra'daki (SN) dopaminerjik nöronların kaybı ve sitoplazma içerisinde Lewy cisimciği adı verilen protein agregatlarının birikimi ile karakterize nörodejeneratif bir hastalıktır. Uzun kodlamayan RNA’ların (long noncoding RNA=lncRNA) ifade düzeylerinde meydana gelen değişimler birçok hastalığın patogenezinde yer almakta ve bu durum lncRNA’ları terapötik hedef ve biyobelirteç adayları haline getirmektedir. Araştırmamızda PH tanısı almış bireylerde lncRNA’lar ve onların hedef mRNA’larını belirlemeyi amaçladık. PAÜ Tıp Fakültesi Nöroloji Anabilim Dalı’na başvuran 50 yaş ve üzeri “PH” tanısı almış 10 kişi ile kontrol grubu için 10 kişiden gönüllü onam formu ve etik kurul izni ile 10 ml periferik kan örnekleri alındı. Periferik kan mononükleer hücre izolasyonları (peripheral blood mononuclear cells=PBMC) density gradient santrifügasyonla gerçekleştirildi. Elde edilen PBMC’lerden total RNA izole edildi ve NanoDrop yardımıyla RNA konsantrasyonu belirlendi. Kontrol grubu ve PH teşhisi almış bireylerden izole edilen total RNA örneklerinden, toplam 5 örnek seçilerek mikrodizin analizi ile değerlendirildi. Analiz sonucunda kat değişimi fazla olan (fc<1.5 / fc>1.5) lncRNA’lar belirlenerek hasta ve kontrol gruplarındaki bireylerin tamamında kantitatif eş zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile bazı lncRNA’ların ve onların hedef mRNA’larının ekspresyon değişimleri araştırıldı. Mikrodizin analiziyle ekspresyon değişimleri belirlenen Lin-7 homolog C (LIN7C), Lenfoid Arttırıcı Bağlanma Faktörü 1 Antisens RNA 1 (LEF1-AS1) ve CAMP-Bağımlı Protein Kinaz İnhibitör Alfa Antisens RNA 1 (PKIA-AS1) lncRNA’ları ile Serin/arginin birleştirme faktörü 10 (SRSF10), SMAD Aile Üyesi 2 (SMAD2), Eomesodermin (EOMES) ve LIM Homeobox 3 (LHX3) mRNA’larına özgün primerler tasarlanarak qRT-PCR yöntemi validasyonu gerçekleştirildi. Azalmış ekspresyon gösteren Lenfoid Arttırıcı Bağlanma Faktörü 1 Antisens RNA 1 (LEF1- AS1) lncRNA ile Eomesodermin (EOMES) ve LIM Homeobox 3 (LHX3) mRNA’larının qRT-PCR sonucunda ifadesinin arttığı saptandı. Diğer yandan Lin-7 homolog C (LIN7C) ve CAMP-Bağımlı Protein Kinaz İnhibitör Alfa Antisens RNA 1 (PKIA-AS1) lncRNA’ları ile Serin/arginin birleştirme faktörü 10 (SRSF10) ve SMAD Aile Üyesi 2 (SMAD2) mRNA’larının mikrodizin analizi ile uyumlu şekilde artan ekspresyonu gözlendi. qRT-PCR sonucunda Lin-7 homolog C (LIN7C) lncRNA ile LIM Homeobox 3 (LHX3) ve Eomesodermin (EOMES) mRNA’ları ekspresyonlarındaki artışlar istatistiksel olarak anlamlı bulundu. Elde edilen bulguların, Parkinsonlu bireylerde yapılacak yeni hedef lncRNA araştırmalarına katkı sağlayacağı kanısındayız.

Parkinson's disease (PD) is a neurodegenerative disease characterized by the loss of dopaminergic neurons in the Substantia Nigra (SN) and the accumulation of protein aggregates called Lewy bodies in the cytoplasm. Changes in the expression levels of long non-coding RNAs (long non-coding RNA = lncRNA) are involved in the pathogenesis of many diseases, and this makes lncRNAs candidates for therapeutic targets and biomarkers. In our study, we aimed to determine lncRNAs and their target mRNAs in individuals diagnosed with PD. 10 ml peripheral blood samples were obtained from 10 people aged 50 and over who applied to the PAU Faculty of Medicine, Department of Neurology with the diagnosis of "PD" and from 10 people for the control group, with voluntary consent and approval of the ethics committee. Peripheral blood mononuclear cell isolations (peripheral blood mononuclear cells=PBMC) were performed by density gradient centrifugation. Total RNA was isolated from the obtained PBMCs and the RNA concentration was determined with the help of NanoDrop. From the total RNA samples isolated from the control group and individuals diagnosed with PH, a total of 5 samples were selected and evaluated by microarray analysis. Expression changes of some lncRNAs and their target mRNAs were investigated by quantitative simultaneous polymerase chain reaction (qRT-PCR) in all individuals in the patient and control groups by identifying lncRNAs with a high fold change (fc<1.5 / fc>1.5) as a result of the analysis. qRT-PCR method validation was carried out by designing Lin-7 homolog C (LIN7C), Lymphoid Enhancer Binding Factor 1 Antisense RNA 1 (LEF1AS-1) and CAMP-Dependent Protein Kinase Inhibitor Alpha Antisense RNA 1 (PKIA-AS1) lncRNAs, whose expression changes were determined by microarray analysis, and specific primers for Serine/Arginine Rich Splicing Factor 10 (SRSF10), SMAD Family Member 2 (SMAD2), Eomesodermin (EOMES) and LIM Homeobox 3 (LHX3) mRNAs. It was determined that the expression of Lymphoid Enhancer Binding Factor 1 Antisense RNA 1 (LEF1-AS1) lncRNA, which showed decreased expression, and Eomesodermin (EOMES) and LIM Homeobox 3 (LHX3) mRNAs, increased as a result of qRT-PCR. On the other hand, increased expression of Lin-7 homolog C (LIN7C) and CAMP-Dependent Protein Kinase Inhibitor Alpha Antisense RNA 1 (PKIA-AS1) lncRNAs and Serine/Arginine Rich Splicing Factor 10 (SRSF10) and SMAD Family Member 2 (SMAD2) mRNAs was observed, consistent with microarray analysis. As a result of qRT-PCR, the increases in expression of Lin-7 homolog C (LIN7C) lncRNA and LIM Homeobox 3 (LHX3) and Eomesodermin (EOMES) mRNAs were found to be statistically significant. We believe that these findings will contribute to new target lncRNA studies to be conducted in the peripheral blood of individuals with Parkinson's disease.