Sitokrom P4501A ve glutatyon S-transferaz'ların mavri kefal balığından(Liza saliens) karakterizasyonu ve değişik dokularda immünolojik tanımlanması

Abstract

Faz I enzimlerinden sitokrom P4501A1 ve Faz II enzimlerinden glutatyon S- transferaz'lar (GST'ler) ilaçlar ve diğer vücuda alınan ekzojen ksenobiyotiklerin detoksifikasyonunda ve dışarı atılmalarında önemli rol oynamaktadırlar. Bu çalışmada, İzmir Körfezi ve çevresinden toplanan doğal kefal balığı {Liza saliens) dokularından mikrozomal ve sitozolik fraksiyonlar elde edildi. Liza saliens karaciğer dokusunda CYP1A1 ve GST'lerin karakterizasyonları, 7-etoksirezorufin ve l-kloro-2,4- dinitrobenzen (CDNB) ve etakrinik asit (EA) substratlan kullanılarak gerçekleştirildi. Liza saliens karaciğer mikrozomlarında EROD için ortalama aktivite 1 139,424 ± 174,75 pmol Rez./dak/mg protein (n=27) olarak bulunmuştur. EROD aktivitesi 100 jıg protein miktarına ve 120 saniye reaksiyon zamanına kadar lineerlik göstermiştir. Optimum pH ve sıcaklık sırasıyla 7,80 ve 35 °C olarak bulunmuştur. Enzim aktivitesinin 1,5 uM 7- ER konsantrasyonu üzerinde satüre olduğu gözlenmiştir. Lineweaver-Burk grafiği kullanılarak yapılan saptamalarda Vmax ve Km değerleri sırasıyla 1250 pmol/dak/mg protein ve 30,25 \ıM olarak hesaplanmıştır. EROD aktivitesi üzerine metallerin ve deterjanların etkisi incelenmiş ve ağır metaller ile deterjanların enzim aktivitesini önemli derecede inhibe ettiği bulunmuştur. Bunlar arasında Hg, Ni, Cd, Cu, Zn ve Sb gibi metaller ve sodyum dodesil sülfat, kolik asit ve deoksikolik asit gibi deterjanlar daha fazla inhibisyona neden olmuştur. Liza saliens sitozollerinde sırasıyla CDNB ve E A için ortalama aktivite 1163,27 ± 265,56 nmol/dak/mg protein (n=27) ve 158,16 + 13,17 nmol/dak/mg protein (n=27) olarak bulunmuştur. GST-CDNB ve GST-EA aktiviteleri 50 jıg protein miktarına kadar lineerlik göstermiştir. GST-CDNB aktivitesi ilk 5 dakika lineerite gösterirken, GST-EA aktivitesi ilk 3 dakika boyunca doğrusallık gösterdi. GST-CDNB aktivitesi için pH 7,50 ve pH 1 1,00 olarak iki farklı optimum pH gözlenirken, GST-EA aktivitesi için pH 7,80 ile 9,00 arasında düzlemsel bir optimum aralık bulundu. Optimum sıcaklık GST-CDNB aktivitesi için 37 °C olarak tayin edilirken, GST-EA aktivitesi için 42 °C olarakVI bulunmuştur. Enzim aktivitelerinin 2 mM CDNB ve 0,1 mM EA konsantrasyonları üzerinde satüre olduğu gözlenmiştir. Lineweaver-Burk grafiği kullanılarak yapılan saptamalarda Vmax ve Km değerleri sırasıyla CDNB ve EA için 1661 nmol/dak/mg protein ve 0,24 mM ve 156 nmol/dak/mg protein ve 0,056 mM olarak hesaplanmıştır. GST-CDNB ve GST-EA aktiviteleri üzerine metallerin ve deterjanların etkisi incelenmiş ve divalent ağır metaller ile deterjanların enzim aktivitesini önemli derecede inhibe ettiği bulunmuştur. Bunlar arasında en fazla inhibisyona Hg, Cd, Sb, Cu ve Zn gibi metaller neden olmuştur. GST-CDNB aktivitesinde en fazla inhibisyona kolik asit, sodyum dodesil sülfat, triton X-100 ve deoksikolik asit gibi deterjanlar neden olurken, GST-EA aktivitesinde en fazla inhibisyona deoksikolik asit, sodyum dodesil sülfat, kolik asit, triton X-100 gibi deterjanlar neden olmuştur. Ayrıca, Liza saliens CYP1A1 ve GST enzimlerinin çevre kirliliği için biyomarkör olarak önemi araştırılmıştır. Anahtar Kelimeler: Sitokrom P4501A1, glutatyon S-transferaz'lar, Liza saliens, CDNB, EA, etoksirezorufin, karakterizasyon

VII Cytochrome P450 and glutathione S-transferases (GSTs) are phase I and II enzymes respectively and play important role in detoxication and excretion of drugs and other exogenous compounds. In this study, microsomal and cytosolic fractions were obtained from the tissues of feral fish leaping mullet (Liza saliens) collected in Izmir Bay. Liza saliens liver CYP1A1 and GSTs were characterized using 7-ethoxyresorufin and 1- chloro-2,4-dinitrobenzene and ethacrynic acid as substrates. Average EROD activity of liver toward 7-ER was found 1 139,424 ± 174,75 pmol Res./min/mg protein (n=27). Liza saliens liver EROD activity was found to be linear up to 100 \ig protein amount and 2 minutes reaction time. In addition, optimum pH and temperature were determined as 7,80 and 35 °C, respectively. Enzyme activity was found to be saturated above 1,5 uM 7-ER concentration. Apparent V,^ and Km values for EROD using Lineweaver-Burk graph were calculated and found to be 1250 pmol Res./min/mg protein ve 30,25 uM. The effects of metals and detergents on Liza saliens liver EROD activity were studied and found that heavy metals and ionic detergents inhibited the enzyme activities significantly. Among them such as Hg, Ni, Cd, Cu, Zn and Sb and detergents such as sodium dodecyl sulfate, cholic acid and deoxycholic acid caused higher degree of inhibition. Average liver GST activities of Liza saliens toward CDNB and EA were found 1163,27 ± 265,56 nmol/min/mg protein (n=27) and 158,16 ± 13,17 nmol/min/mg protein (n=27). Liza saliens liver GST-CDNB and GST-EA activities were found to be linear up to 100 \ig protein amount. While GST-CDNB activity was displayed linearity at first 5 minutes, GST-EA activity was displayed linearity at first 3 minutes. While two pH optima (pH 7,50 and 11,00) were observed for GST-CDNB activity, GST activity towards EA showed a plateau between pH 7,80-9,00. GST-CDNB showed optimum temperature at 37 °C. On the other hand, GST activity with EA showed a wider temperature activity curve with optimum temperature at 42 °C. Enzyme activities wereVIII found to be saturated above 2 mM CDNB and 0,1 mM EA concentrations. Apparent Vmax and Km values for CDNB and EA using Lineweaver-Burk graph were calculated and found to be 1661 nmol/min/mg protein and 0,24 mM and 156 nmol/min/mg protein and 0,056 mM, respectively. The effects of metals and detergents on Liza saliens liver GST-CDNB and GST-EA activities were studied and found that heavy metals and ionic detergents inhibited the enzyme activities significantly. Among them the highest degrees of inhibitions were detected with metals such as Hg, Cd, Sb, Cu and Zn and with detergents such as cholic acid, sodium dodecyl sulfate, triton X-100 and deoxycholic acid. Furthermore, the importance of CYP1A1 and GST enzymes of Liza saliens as biomarkers of environmental pollution was investigated. Key Words: Cytochrome P4501A1, glutathione S-transferases, Liza saliens, CDNB, EA, ethoxyresorufin, characterization