Hepatoselüler kanser gelişiminde sitokrom P4501A1 (CYP1A1), hepatit bx (HBX) ve nüklear faktör kappa b (NF-kB etkileşimlerinin roiü

Abstract

Bu çalışmada, Hepatit B X (HBX), Sitokrom P450 1A1 (CYP1A1) ve Nüklear Faktör kappa B (NF-kB) proteinlerinin Hepatit B Virüs aracılı insan karaciğer kanser hücre hattında (HepG2) protein-protein etkileşim potansiyelinin moleküler yaklaşımlar ile aydınlatılması amaçlanmıştır. Bu amaçla HepG2 hücrelerine CYP1A1 ve NF-kB (ReLA) genlerinin geçici transfeksiyonu yapılmıştır. Transfeksiyondan sonra HBX, CYP1A1 ve ReLA genlerinin HepG2 hücrelerinde mRNA düzeyinde ifadelerinin saptanması Ters Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PZR) yöntemi ile belirlenmiştir ve CYP1A1 aktivitesi tayin edilmiştir. CYP1A1 ve ReLA genlerinin hücre yaşamı üzerine etkileri araştırılmıştır. CYP1A1 geninin protein düzeyinde ifadesi Westren Blot yöntemi ile saptanmıştır. CYP1A1, HBX proteinlerinin protein-protein etkileşimleri İmmün Çöktürme analizi ile tayin edilmiştir. Deneyler sonucunda HepG2 hücrelerine aktarılan CYP1A1 ve ReLA genlerinin transfeksiyon verimliliğinin %20-%40 olduğu tespit edilmiştir. CYP1A1 ve ReLA genlerinin mRNA düzeyinde ifadelerinin ve CYP1A1 enzim aktivitesinin olduğu belirlenmiştir. CYP1A1 ve ReLA genlerinin HepG2 hücrelerine toksik etki göstermediği saptanmıştır. Yapılan Western Blot çalışmalarında CYP1A1?in protein düzeyinde ifadesinin insan karaciğer kanser hücrelerinde az miktarda olduğu belirlenmiştir. İmmün çöktürme çalışması HepG2 hücrelerinde CYP1A1 ve HBX?in protein-protein etkileşimlerinin olmadığını göstermiştir. Sonuç olarak, HBX geni aktarılmış insan karaciğer kanser hücresinde HBX geni ile CYP1A1 geninin protein düzeyinde protein-protein etkileşimlerinin olmadığı tespit edilmiştir. Bu durumun da, HBV mekanizmasında CYP1A1 geninin rol oynamadığını düşündürmektedir. Anahtar Kelimeler: Hepatoselüler karsinom, Hepatit B X protein, Sitokrom P450

In this study, the potential interactions among Hepatitis BX (HBX), Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) and Nuclear Factor Kappa B (NF-?B) proteins in Hepatitis B virus mediated human liver cancer cell line (HepG2) were studied using molecular approaches. For this purpose, CYP1A1 and NF-kB (RelA) genes were transiently transfected into HepG2 cells. After transfection, HBX, CYP1A1 and RelA levels were detected by measuring the related mRNA expressions using Reverse Transcriptase Polymerase Change Reaction (RT-PCR). In addition, CYP1A1 protein level was also determined by measuring CYP1A-directed EROD activity and western blot using specific anibodies against human CYP1A1. Similarly, RelA expressions were investigated by westren blotting. Furthermore, the effect of CYP1A1 and RelA expressions on the survival of HepG2 cells were monitored using cytotoxicity assays. Finally, the protein-protein interactions between CYP1A1 and HBX was determined by co-immunoprecipitation analysis. The transfection efficiency of CYP1A1 and RelA genes in HepG2 cells were observed between 20%-40%. The level mRNA expression of CYP1A1 and RelA genes and EROD activity further confirmed the low level of tranfection efficiencies. CYP1A1 and RelA did not show any toxic effects on the survival of the HepG2 cells. Western blot studies demonstrated the low level expression of CYP1A1 protein in these cells. Co-immunoprecipitation analysis clearly depicted that there is no protein-protein interaction between CYP1A1 and HBX in the HepG2 cells. Therefore, HBX CYP1A1 proteins do not interact with each other in HBX transfected human liver cancer cells. Consequently CYP1A1 gene may not play a role in the mechanism of HBV. Key words: Hepatit B X protein, Cytohrome P450 1A1, Nuclear Factor Kappa B