Ellajik asitin ksenobiyotik metabolizması üzerine etkilerinin ve ilaç-diyet etkileşim potansiyelinin moleküler yaklaşımlar ile aydınlatılması

Abstract

Bu çalışmada ellajik asitin ksenobiyotik metabolizması üzerine etkilerinin ve ilaç-diyet etkileşim potansiyelinin moleküler yaklaşımlar ile aydınlatılması amaçlanmıştır. Bu amaçla sıçanlara iki farklı dozda ellajik asit enjekte edilmiş ve sıçan karaciğer mikrozomal 7-etoksirezorufin O-deetilaz (CYP1A1), aminopiren N-demetilaz (CYP2A, 2C), anilin 4-hidroksilaz (CYP2E1), dibenzoflorosein debenzilaz (CYP19-aromataz), eritromisin N-demetilaz (CYP3A1), etilmorfin N-demetilaz (CYP2B1), kafein N-demetilaz, (CYP1A2), N-nitrosodimetilamin N-demetilaz (CYP2E1) Metoksirezorofin O-demetilaz (CYP1A2) benziloksirezorofin o-dealkalaz (CYP2B9), pentoksirezorofin O-dealkalaz (CYP2B10), benzfetamin N-demetilaz (CYP2B), sitozolik glutatyon S-transferaz ve kinon reduktaz (NQO1) aktiviteleri tayin edilmiştir. Ellajik asitin etkilerinin moleküler düzeyde tanımlanması için aktiviteleri ölçülen enzimlerin gen ifade düzeyleri, RT-PCR yöntemi ile semi-kantitatif olarak saptanmıştır. Sıçan karaciğer mikrozomal ve sitozolik enzimlerin her birine özgü antikorlar kullanılarak Western blot tekniği ile her bir enzim izoformlarının protein düzeyleri immunolojik olarak tayin edilmiştir. Ellajik asitin kanser hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisini saptamak ve var ise normal ve kanser hücre dizileri üzerindeki sitotoksisite farklarını belirlemek amacıyla hem kanser olmayan hücre dizileri (ebriyonik böbrek hücre dizisi 293 ve fibroblast hücre dizisi 3T3) hem de kanser hücreleri (meme kanseri hücre dizisi MCF7, akciğer kanseri hücre hattı PC-14) üzerine sitotoksik etki araştırılmıştır. Hücreler üzerinde sitotoksik özelliği saptanan ellajik asitin bu sitotoksik etkisini hangi mekanizmayı kullanarak gerçekleştirdiği sorusuna cevap aramak için PTEN ve p53'ün tümör baskılayıcı gen ekspresyonlarına etkisi Western blot analizi ile araştırılmıştır. Ayrıca antioksidan enzimler (katalaz ve glutatyon peroksidaz), serum aspartat ve alanin aminotransferaz aktiviteleri ölçümleri ile ellajik asitin antioksidatif, oksidatif ve olası toksik etkileri saptanmıştır. 10 mg/kg ellajik asit uygulanan dozlarda CYP2B ve CYP2E enzim aktiviteleri azaldığı halde, diğer tüm aktivitelerinde herhangi bir değişiklik gözlenmemiştir. Ayrıca Western blot ve RT-PCR sonuçları ile bu enzim aktiviteleri uyum göstermiştir. Diğer yandan 30 mg/kg ellajik asit intaperitonal olarak uygulandıktan sonra NQO1, CAT, GPX, GSTs enzim aktiviteleri önemli derecede artarken CYP450 1A1, 2B1, 2B4, 2B9, 2B10, 2C6, 2E1 ve 19 enzim aktiviteleri önemli derecede azalmıştır. Buna ek olarak Western blot ve RT-PCR sonuçları anlamlı şekilde CYP2B, 2C6, 2E1 ve 19 protein ve mRNA seviyeleri azalmıştır fakat CYP1A mRNA ve protein seviyesi değişmemiştir. CYP3A enzim aktivitesi ve protein ve mRNA seviyesi ne 10 mg/kg ellajik asitte ne 30 mg/kg ellajik asitte değişmemiştir. Sonuç olarak ellajik asitin ksenobiyotik metabolizmasında etken bir role sahip olan sitokrom P450 enzimlerinin ekspresyonlarında değişimlere neden olarak ksenobiyotik metabolizmasını değiştirdiğini, antioksidatif, antimutajenik ve antikanserojenik etkiler gösterdiğini saptanmıştır.

The purpose of this project is to elucidate effects of ellagic acid on xenobiotic metabolism and its drug-diet ınteraction potentials using molecular approaches. For this purpose, ellagic acid was injected to rats in two different doses and then their hepatic microsomal 7-ethoxyresorufin O-deethylase (CYP1A1),aminopyrene N- demethylase (CYP2A, 2C), aniline 4-hydroxylase (CYP2E1), caffeine N-demethylase (CYP1A2), dibenzofluoroscein demethylase (CYP19-aromatase), erythromycin N-demethylase (CYP3A1), ethylmorphine N-demethylase (CYP2E1), caffeine N-demethylase (CYP1A2), N-nitrosodimethylamine N-demethylase (CYP2E1), methoxyresorufin O-demethylation (CYP1A2), benzyloxyresorufin O-dealkylatase (CYP2B9), pentyloxyresorufin O-dealkylatase (CYP2B10), benzphetamine N-demethylase (CYP2B), cytosolic glutathione S-transferase (GST) and quinone reductase (NQO1) activities activities are going to be determined.In order to determine the molecular mechanism of actions of ellagic acid gene expression levels of xenobiotic metabolizing enzymes given above was determined with the semi quantitative, RT-PCR. Expression levels of xenobiotic metabolizing enzymes given above at the protein level was be studied by Western blotting using specific antibodies against individual isoforms. Cytotoxic effects of ellagic acid on non cancer cell lines (293 and 3T3) and cancer cells lines (breast cancer cell line MCF-7 and lung cell lines PC-14) was be compared. Tumor suppressor genes such as PTEN and p53 and was be studied in those cell lines with Western blotting to clarify the underlying mechanism of cytotoxic actions observed with ellagic acid. In addition, effect of ellagic acid on antioxidant enzymes (catalase and glutathione peroxidase) and aspartate and alanine aminotransferases and was be determined to study the oxidant, antioxidant possible toxic properties of extracts and pure constituents. Although the CYP2B and CYP2E enzyme activities were decreased, the activities of all other enzymes were not changed significantly with 10 mg/kg EA injection. In addition, Western-blot and qRT-PCR results clearly corroborated the above enzyme expressions. On the other hand, while the NQO1, CAT, GPX, GSTs enzyme activities were increased significantly, CYP450 1A1, 2B1, 2B4, 2B9, 2B10, 2C6, 2E1 and 19 enzyme activities were reduced significantly by an i.p. administration of 30 mg/kg ellagic acid. In addition, Western-blot and RT-PCR results markedly indicated that CYP2B, 2C6, 2E1 and 19 protein and mRNA levels were substantially decreased by 30 mg/kg dose of EA, but the CYP1A protein and mRNA levels were not changed. CYP3A enzyme activity, protein and mRNA levels were not altered by neither 10 nor 30 mg/kg ellagic acid. As a result, ellagic acid altered xeonobiotic metabolism by cause change in the expression of CYP450 enzymes which has an active role in the xenobiotic metabolism, it?s reported that shown antioxidative, antimutagenic an anticancerogenic effects.