Lactococcus lactis spp. lactis (NRRL-1821) kaynaklı dipeptidil peptidaz IV enziminin kinetik özelliklerinin belirlenmesi

Abstract

Bu çalışmada, Dipeptidil peptidaz IV enziminin (DPP IV, EC 3.4.14.5) üretimi saflaştırılması ve karakterizasyonu yapılmıştır. Dipeptidil peptidaz IV enzimi tüm doku, organ ve sistemlerin düzenlenmesinde rol alan, nörolojik, immünolojik ve gastroenterolojik açıdan araştırılan önemli bir enzimdir. Enzimin üretiminde Lactococcus lactis spp. lactis suşu kullanılmıştır. Üretim için kullanılan inokülasyon oranı %5 olarak belirlenmiştir. Üretim sonrasında hücreler sonikasyon ile parçalanmış, sonikasyon işlemi optimize edilmiş ve optimum parçalama parametreleri 28 dakika, %91 güç ve döngü 3 olarak belirlenmiştir. Parçalama işlemi ile hücre dışına çıkarılan enzime ultrafiltrasyon ve %70 amonyum sülfat çöktürmesi uygulanmıştır. Ön işlemleri yapılan enzim iyon değiştirici kolon ve jel filtrasyon kolonundan geçirilerek %59,29 oranında saflaştırılmıştır. Saflaştırma işlemi sonucunda spesifik aktivite 11151,154 mU/mg, verim %6,9 ve saflaştırma katsayısı 22,54 olarak hesaplanmıştır. Elde edilen fraksiyonların SDS-PAGE analizi ile saflığı, kütle spektrometrisi ile peptit dizilişi ve molekül ağırlığı belirlenmiştir. DPP IV enziminin molekül büyüklüğü 87,58 kDa olarak bulunmuştur. DPP IV enziminin kinetik özelliklerinin belirlenmesi için yapılan çalışmalar sonucunda optimum sıcaklık 40°C ve optimum pH 8,0 olarak bulunmuş; spesifik substrat Gly-Pro-pNA olarak belirlenmiş; EDTA, PMSF, Mg+2,Ca+2,Fe+2,Zn+2,Hg+2 iyonları ve Gly-Pro-Phe, Gly-Pro-Ile, Phe-Val- Val-Asn-Ala peptit dizileri kullanılarak inhibisyon mekanizmaları çalışılmış Hg+2Zn+2ve Ca+2 iyonlarının en yüksek inhibitör etkiye sahip olduğu bulunmuştur. Saflaştırılan enzim ticari enzimlerle kıyaslanmış ve saflaştırılan enzimin enzim aktivitesinin en yüksek aktiviteye sahip ticari enzimin 14,32 katı olduğu belirlenmiştir. Çalışmamızdan elde ettiğimiz verilere göre Lactococcus lactis spp. lactis’ten elde ettiğimiz ve saflaştırdığımız DPP IV enzimi ticari enzimler ile rekabet edebilecek düzeyde bir enzim aktivitesine sahip bulunmuştur.

In this study, production, purification and partial characterization of Dipeptidyl peptidase IV (DPP IV, EC 3.4.14.5) enzyme were performed. Dipeptidyl peptidase IV is an important enzyme that involve in the regulation of all tissues, organs and systems. The enzyme has been investigated neurological, immunological and gastroenterological studies. Lactococcus lactis spp. lactis strains were used for the enzyme production. Inoculation ratio was determined as 5%. After production, the cells were disrupted by sonication. Optimized sonication parameters were found as 28 min, 3 cycle and power 91%. Ultracentrifugate and ammonium sulfate precipitation (70%), ion exchange column and gel filtration column were performed to extracted enzyme. As a result of the purification process, specific activity of the enzyme, yield and purification fold was 11151,154 mU/mg, 6,9% and 22.54, respectively. The molecular weight of the enzyme was 87,58 kDa and the purity was calculated as 59.29%. The optimum temperature value was measured as 40°C and optimum pH value was found as 8.0. As a specific substrate Gly-Pro-pNA had more affinity to the enzyme than Ala-Pro-pNA. Inhibition mechanisms were conducted by using EDTA, PMSF, Mg+2, Ca+2, Fe+2, Zn+2, Hg+2 ions and Gly-Pro-Phe, Gly-Pro-Ile, Phe-Val-Val-Asn-Ala peptide sequences. Hg+2, Mg+2 and Ca+2 ions were have the highest inhibitor effect. The purified enzyme was compared with commercial enzymes, and the enzyme activity of purified DPP IV enzyme was found to be 14,32 times higher than the commercial enzyme, which has the highest DPP IV activity. As a result of the study, partially purified DPP IV enzyme from Lactococcus lactis spp. lactis can be compare able to commercial enzymes in term of the enzyme activity.