Anormal hemoglobinlerin tanısında MLPA tasarımı

Abstract

MLPA, Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification kelimelerinin baş harflerinden oluşmuş olup, ligasyona bağımlı çoklu prob amplifikasyonu anlamına gelmektedir. Yöntem ilk olarak Schouten ve ark. tarafından 2002 yılında tanımlanmıştır ve MLPA yöntemiyle birden fazla odaktaki gen delesyonları ile duplikasyonları tek bir reaksiyonla tanımlanabilmektedir. Çalışılan bölgedeki gen miktarlarının belirlenmesi amacını taşıyan MLPA yönteminde, gen bölgelerinde tek veya her iki allelde meydana gelebilecek delesyonlar ve duplikasyonlar nedeni ile oluşan gen miktarlarındaki artış ve azalışlar görüntülenebilmekte ve hesaplanabilmektedir. Anormal hemoglobine yol açan globin gen yapısındaki değişiklikler proteinin yapı ve işlevine yansımaktadır. Elektroforetik ve kromatografik yöntemlerle anormal hemoglobinlerin davranış değişikliği, DNA dizi analizi ile değişikliğe neden olan gensel özellik saptanıp anormal hemoglobin kimliklendirilmesi gerek toplum ve gerekse de premarital (doğum öncesi) taramalarda birçok zorlukla karşılaşılabilmektedir. Tez çalışmasında; Hb S için bir MLPA sistemi tasarlanarak, MLPA yöntemi ile Hb S modelinde ilgili mutasyonun tanımlanması ve tek nükleotit değişikliklerinin saptanmasında MLPA yönteminin kullanılabilirliği irdelenmiştir. Çalışmamızda Pamukkale Üniversitesi Biyofizik Anabilim Dalı DNA bankasından Hb S heterozigot ve Hb S homozigot örnekler kullanılmıştır. Bu amaçla, hem beta globin geninin 6. kodonunda meydana gelen GAG>GTG mutasyonu ile oluşan Hb S' in, hem de kodon 2 CAC >CAT ve kodon 5 ?CT polimorfizmlerinin varlıklarının MLPA yöntemi üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Sonuç olarak, MLPA yönteminin, geliştirilmesi ve sonuçların daha özgün hale getirilmesi ile anormal hemoglobinlerin ve tek nükleotit değişikliklerin belirlenmesinde bir tanı yöntemi olarak kullanılabilirliğine ilişkin veriler elde edilmiştir.

MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) is a multiplex PCR method discribed by Schouten et al in 2002. This method includes the detection of exon deletions, duplications and abnormal copy numbers of different genomic DNA samples, also allows multiple targets to be amplified with only a single primer pair. Dosage quotients may be calculated for any pair of amplicons caused by any gene deletion or duplication. Abnormal hemoglobins present different electrophoretic and chromatographic behaviors. These genetic differences can be identified with DNA sequencing methods. These molecular methods pose some difficulties in the molecular diagnosis of abnormal hemoglobins also with cost ineffective problems in premarital and prenatal diagnostic approaches. In this thesis study, Hb S was used as an abnormal hemoglobin target and probe consists of a two oligonucleotides which recognise target sites on the DNA or PCR product. Heterozygous and homozygous Hb S samples were from DNA Bank in Pamukkale University Department of Biophsics. According to the obtained results, in beta globin gene mutation on sixth codon resulting GAG>GTG, on second codon polymorphism CAC>CAT and fifth codon mutation resulting ?CT were investigated by MLPA method. Depending on our results, we can conclude that as a diagnostic approach, MLPA method can be improved to detect abnormal hemoglobin variants and single nucleotide differences.