2D ve 3D ishikawa endometrial karsinom hücre kültüründe lityum, metformin ve everolimus maddelerinin hücre büyümesi üzerine etkileri

Abstract

Gelişmiş ülkelerde en sık görülen jinekolojik kanser endometrial kanserdir. Biyolojik, moleküler ve klinikopatolojik özelliklerine göre iki tipe ayrılır. Vakaların %80 i Tip I (endometrioid histoloji) tümörlerden oluşmaktadır. Tip I tümörler düşük dereceli (FIGO grade 1 ve grade 2) tümörlerdir, genellikle endometrial hiperplazi ile ortaya çıkarlar ve iyi prognozludurlar. Tip II tümörler yüksek dereceli (FIGO garde 3 ve üstü) ve endometrioid olmayan histolojik alt tipleri içerirler. Genellikle atrofik endometrium zemininde ortaya çıkarlar, östrojen bağımlı değillerdir ve yüksek gradeli kötü prognozlu neoplazmlardır. Her yıl binlerce hasta bu nedenle ölmektedir. Günümüzde kanser çalışmalarında ve kişiye özel kemoterapi planlamalarında iki boyutlu hücre kültürü çalışmalarından vazgeçilmektedir. 3 boyutlu (3D) hücre kültürlerinin in vivo ortamı 2 boyutlu (2D) kültürlerden daha iyi taklit ettiği düşünülmektedir Endometrial kanserlerde erken evre ve metastatik olmayan rezektabl tümörlerde cerrahi uygulanmaktadır. Nihai tedavi patolojik tanıyla kesinleşen histolojik alt tipe göredir. Orta riskli endometrial kanser hastalarında ameliyat sorası radyoterapi (RT) ve kemoterapi (KT) uygulanmaktadır. Yüksek riskli hastalarda ameliyat sonrası KT mutlaka uygulanmaktadır. Karboplatin, sisplatin ve doksorubisin sık kullanılan ilaçlar arasındadır. Çalışmamızın amacı endometrial kanser hücresi olan Ishikawa hücre hattında everolimus, metformin ve lityumun hücre canlılığına olan etkilerini araştırmak, IC50 (the half maximal inhibitory concentration; bir ilacın hücrelerin yarısını öldürdüğü doz) dozlarını saptamak, hücre proliferasyonuna, invazyonuna, koloni oluşumuna, hücre döngüsü ve apoptoz mekanizmalarına etkilerini ve terapötik etkinliklerini in vitro koşullarda belirlemektir. Ayrıca Midkine, PI3K, AKT, AMPK protein seviyelerine ELİSA testiyle, CASP3, CASP8, CASP9, FADD, TRADD, MAP1LC3A, MAP1LCA3B, MTOR, BECLİN1, PIK3CA, PIK3CB, AKT, TNF, FASL’ ı RT-PCR ile apoptozu ise Flow sitometride Annexin V ile değerlendirmektir. Everolimus, metformin ve lityumun IC50 değerleri 48. Saate sırasıyla 37,46 nM, 48,59 mM, 100 ?M olarak bulunmuştur. Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) sonuçlarına göre maddelerin ve kombinasyon şekillerinin hücre döngüsü ve apoptoz ile ilişkili genler üzerine etkileri olduğu tespit edilmiştir. ELİSA deneyi ile bakılan protein düzeylerinde anlamlı değişiklikler saptanmıştır. Matrigel invazyon testi ile kontrol gruplarına göre doz gruplarında Ishikawa hücrelerinin invazyon kapasitelerinin azaldığı belirlenmiştir. Koloni formasyon testi ile de kontrol gruplarına oranla doz gruplarında koloni oluşumunun belirgin oranda baskıladığı tespit edilmiştir. Wound healing deneyi sonuçları ile doz gruplarında hücre göçü ve hücre-hücre etkileşiminin belirgin oranda azaldığı gösterilmiştir. Flow sitometri ile kullandığımız tekli ve kombine dozların apoptozu ve hücre ölümünü belirgin olarak artırdığı gösterilmiştir. Çalışma sonuçları Everolimus, Lityum ve Metformin kombinasyonlarının endometrial kanser tedavisinde anti kanserojen ajan olarak daha düşük dozlar şeklinde kullanılabileceğini göstermiş ve daha detaylı çalışmalar için veriler ortaya koymuştur.

Endometrial cancer is the most common gynaecological cancer in developed countries. It is divided into 2 groups on the basis of biological, moleculer and clinicopathological features. 80% of the cases consist of Type I (endometrioid histology) tumors. Type I tumors are low grade (FIGO grade 1 and grade 2) and usually occur with endometrial hyperplasia and have a good prognosis. Type II tumors include high grade (FIGO grade 3 and above) and non-endometrioid histological subtypes. They usually occur on the atrophic endometrium background and they are estrogen independent, high grade neoplasms with poor prognosis. Thousands of patients have died for this reason. Currently, two-dimensional cell culture studies are abandoned in cancer studies and personal chemotherapy planning. 3-dimensional (3D) cell cultures are thought to mimic the in vivo environment better than 2-dimensional (2D) cultures. Surgery is an option at an early stage and non-metastatic resectable tumors in endometrial cancers. The final treatment is based on the histological subtype which is confirmed by the pathological diagnosis. Patients with intermediate risk endometrial cancer get post-operative radiotherapy (RT) and chemotherapy (CT). Post-operative chemotherapy should be given to high risk patients. Carboplatin, cisplatin and doxorubicin are among commonly used drugs. The aim of our study is to investigate the effects of Everolimus, Metformin and lithium on cell viability in the Ishikawa cell line, to determine the IC50 (the half maximal inhibitory concentration; the dose at which a drug kills half of the cells)dosage effects on cell proliferation, invasion, colony formation, cell cycle, apoptosis mechanisms and therapeutic activities in in vitro conditions. Additionally, Midkine, PI3K, AKT, AMPK protein levels Eveluated with ELİSA test, CASP3, CASP8, CASP9, FADD, TRADD, MAP1LC3A, MAP1LCA3B, MTOR, BECLİN1, PIK3CA, PIK3CB, AKT, TNF, FASL Eveluated with RT-PCR and Annexin V is Eveluated with PCR. IC50 levels of Everolimus, Metformin and lithium were found as 37.46 nM, 48.59 mM and 100 ?M at 48th hour, respectively. According to the results of Real Time PCR (RT-PCR), it has been determined that the substances and their combination types have effects on cell cycle and genes associated with apoptosis. Significant changes were detected in protein levels measured by ELİSA test. With the Matrigel invasion test, it was determined that the invasion capacity of Ishikawa cells decreased in the dose groups compared to the control groups.The colony formation test has been shown that colony formation was significantly suppressed shown in the dose groups compared to the control groups. With the results of Wound healing experiment, it has been shown that cell migration and cell-cell interaction are significantly reduced in dose groups. Flow cytometri has been revealed that the single and combined doses significantly increase apoptosis and cell death. The results of the study has been presented that the combinations of Everolimus, lithium and Metformin could be used in lower doses as an anticarcinogenic agent in the treatment of endometrial cancer and has provided data for more detailed studies.