Yenidoğan ratlarda oluşturulan astrosit hücre kültüründe bilirübin nörotoksisitesine rekombinant eritropoetinin etkisi

Abstract

Yenidoğanlarda halen önemli bir problem olan bilirübin nörotoksisitesinin hücresel ve moleküler mekanizmaları tam olarak bilinmemektedir. Fizyolojik düzeylerde indirekt bilirübin oksidatif strese karşı koruyucu iken; orta-ağır hiperbilirübinemi oksidatif ve nitrözatif stres, lipid peroksidasyonu, proinflamatuar sitokinlerin salınımı ve ekstraselüler glutamat birikimini tetikleyerek sinir hücresinde nekroz veya apopitozise, klinik olarak akut bilirübin ensefalopatisi veya kernikterusa yol açabilmektedir. Eritropoetin (Epo), antiapopitotik, antiinflamatuar, antioksidan, antinitrozatif, anjiojenik ve nörotrofik mekanizmalarla nöronları sitotoksisiteden korumaktadır. Ancak hiperbilirübinemiye bağlı nörotoksisiteye Epo’nun etkisi henüz bilinmemektedir. Bu çalışmada primer astrosit hücre kültürü oluşturulan yenidoğan ratlarda bilirübin nörotoksisitesine Epo’nun etkisi araştırıldı. Çalışmamızda bir günlük Wistar albino ratlardan modifiye Cole ve De Vellis yöntemi ile elde edilen astrosit hücre kültürü kullanıldı. Astrosit hücrelerinin %50’sine toksik etkili olan indirekt bilirübin konsantrasyonu (TC50) 50 ?M, hücre canlılığını %100 arttıran Epo konsantrasyonu 2.5 IU/ml olarak saptandı. Bilirübin toksisitesine bağlı görülen apopitozis TUNEL boyama yöntemiyle değerlendirildi. İndirekt bilirübinden dört saat önce ve sonra Epo uygulanan astrosit hücre kültüründe 24 saat sonra apopitozis, katalaz, süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GPx), laktat dehidrojenaz (LDH) aktivitesi, glutatyon, malondialdehid (MDA), total nitrat/nitrit, intelökin (IL)-1?, IL-6 ve TNF-? düzeyi, 72 saat sonra hücre canlılığı değerlendirildi. Bilirübin grubunda, apopitozis oranının kontrol grubundan 50 kat fazla arttığı; hücre canlılığının %75 azaldığı saptandı. Profilaktik ve tedavi edici Epo uygulaması, bilirübinin indüklediği apopitozisi, total nitrat/nitrit, IL-6, TNF-? düzeyini azaltırken; hücre canlılığı, katalaz, GPx aktivitesi ve glutatyon, IL-1? düzeyini arttırdı. Profilaktik Epo, LDH aktivitesini arttırırken; tedavi edici Epo LDH aktivitesini azalttı. Gruplar arasında SOD ve MDA düzeyleri bakımından anlamlı bir farklılık yoktu. Bu çalışmada, ilk kez profilaktik ve tedavi edici olarak uygulanan Epo’nun, antiapopitotik, antioksidan, antiinflamatuar ve antinitrozatif özellikleri ile bilirübin nörotoksisitesine karşı koruyucu etkisinin olduğu gösterildi. Cellular and molecular mechanism of bilirubin neurotoxicity, which is still an important problem of newborns, is not exactly known. While indirect bilirubin in physiological level is against oxidative stress; moderate-severe hyperbilirubinemia can cause necrosis or apoptosis in neurons, and cause clinically acute bilirubin encephalopathy or kernicterus, by inducing oxidative stress, lipid peroxidation, proinflammatory cytokine releasing and extracellular glutamate deposition. Erythropoietin (Epo) can protect the neuron cells from cytotoxicity by antiapoptotic, anti-inflammatory, antioxidant, antinitrosative, angiogenic and neurotrophic mechanisms. However, the effect of Epo on neurotoxicity caused by hyperbilirubinemia has not been known yet. In this study, the effect of Epo on bilirubin neurotoxicity in newborn rats’ primer astrocytes cell culture is investigated. In our study, astrocyte cell cultures of one-day-old Wistar albino rats were used, which were obtained from modified Cole and De Vellis method. The indirect bilirubin concentration that has toxic effect on 50% of astrocyte cells (TC50) was detected as 50 ?M and Epo concentration that increase cell viability as 100% was found 2.5 IU/ml. Apoptosis due to bilirubin toxicity was evaluated by TUNEL staining technique. After and before four hours bilirubin incubation Epo treatment was administered. In astrocyte cell cultures, apoptosis, catalase, superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx), lactate dehydrogenase (LDH) activities, glutathione, malondialdehyde (MDA), total nitrate/nitrite, interleukin (IL)- 1?, IL-6 and TNF-? levels were investigated after 24 hours of bilirubin incubation and also cell viability after 72 hours was evaluated. In bilirubin group, it was detected that cell viability decreased in 75% and that apoptosis rate increased in fifty times more than the control group. Although prophylactic and therapeutic Epo application decreased apoptosis, total nitrate/nitrite, IL-6, and TNF-? levels induced by bilirubin, it increased cell viability, catalase and GPx activities, glutathione and IL-1? levels. While prophylactic Epo increased LDH activity; therapeutic Epo decreased it. There was not any significantly difference in between the groups in terms of SOD and MDA levels. In this study, it was the first time shown that prophylactic and therapeutic Epo had protective effects on bilirubin neurotoxicity because of antiapoptotic, antioxidant, antiinflammatory and antinitrosative properties.