Ovcar-3 ovarian adenokarsinoma hücre hattında sisplatin, paklitaksel ile alfa lipoik asit antioksidan bileşiğin tekli veya kombinasyonlar şeklinde uygulanmasının anti-kanser etkileri

Abstract

Over kanseri dünya çapında jinekolojik kanser ölümlerinin önde gelen nedenidir.Over kanseri için mevcut standartlaştırılmış tedavi, optimal sitoredüktif cerrahiyle birlikte paklitaksel ve platin bazlı kemoterapidir (KT). Sisplatin, paklitaksel gibi over kanserinde en sık kullanılan kemoterapi ajanlarına karşı gelişen direnç ve yan etkiler bu tedavi protokollerinde karşımıza çıkan zorluklardır. Bu sorunları azaltmak için toksik olmayan ve bu ilaçlara alternatif / benzer yollarda çalışan, böylece over kanserinde ek tedavi seçenekleri sunan yeni ilaçların araştırılması önemlidir. Bu yeni ajanlardan biri de doğal bir antioksidan olan alfa lipoik asit (ALA) tir. Çeşitli kanser türlerinde tedaviye ek olarak verilen ALA reaktif oksijen türlerini (ROS) temizleme ve endojen antioksidanları yenileme yeteneği sayesinde hücresel büyümede önemli bir rol oynar.Bu projede OVCAR-3 insan ovarian adenokarsinoma hücre hattında sisplatin, paklitaksel kemoterapötik ajanları ile ALA antioksidan bileşiğinin tekli veya kombinasyonlar şeklinde uygulamanın etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmamızda OVCAR-3 insan ovarian adenokarsinom hücre hattı kullanıldı. Hücre canlılığına olan etkilerini, IC50 (the half maximal inhibitory concentration) dozlarını XTT [2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl) 2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide] testi ile değerlendirdik. XTT testi ile IC50 dozları bulundu ve gruplar oluşturuldu. Dozlara göre grup isimleri şu şekildedir; kontrol, ALA IC50, Sisplatin C50+Paklitaksel IC50, ALA IC50+Sisplatin IC50+Paklitaksel IC50. Apoptoz, hücre döngüsü, PI3K (Fosfatidilinositol-3-kinaz)-AKT (Serin/Treonin kinaz, protein kinaz B) yolağı ve tümör hücresi adezyonlarıyla ilişkili genlerin ekspresyonları Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Real Time-PCR, RT-PCR) ile değerlendirildi. p-AKT (phosphorylated Akt), p-mTOR (phosphorylated mammalian target of rapamycin), p-FOXO1 (phosphorylated forkhead box O1) ve MAPK (Mitogen-activated protein kinase) protein seviyeleri ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) yöntemiyle incelendi. Yara iyileşme deneyi (wound healing deneyi), matrigel invazyon testi ve koloni oluşum deneyleri yapıldı. Total oksidan ve total antioksidan düzeyleri TAS (Total Antioxidant Status) ve TOS (Total Oxidant Status) deneyleriyle değerlendirip bu sonuçlara bağlı olarak; TOS'un TAS'a bölünmesiyle oksidatif stres indeksi (OSI) değerleri hesaplandı. Apoptoz Annexin V ve TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP [2'-deoxyuridine 5'-triphosphate] nick end labeling) yöntemleri ile incelendi. Böylece ALA’nın sisplatin ve paklitaksel ile olası terapötik etkinliklerini in vitro koşullarda ortaya koymayı amaçladık. ALA, sisplatin, paklitaksel IC50 değerleri XTT testi ile 48. saatte sırasıyla 83.1 ?M (mikromolar), 10.6 ?M, 19 nM (nanomolar) olarak tespit edildi. RT-PCR sonuçlarına göre maddelerin ve kombinasyon uygulamalarının apoptoz, hücre döngüsü, PI3K-AKT yolağı ve tümör hücresi adezyonlarıyla ilişkili genlerin ekspresyonları üzerine etkileri olduğu saptandı. ALA’nın hem tek başına hem de ALA+sisplatin+paklitaksel ile üçlü doz grubunda PI3K-AKT yolağını baskıladığı tespit edildi.ELISA yönteminden elde edilen sonuçlara göre p-AKT, p-mTOR protein seviyelerinde en belirgin azalma sisplatin+paklitaksel grubunda, p-FOXO1 ve MAPK protein seviyelerinde ise ALA+sisplatin+paklitaksel üçlü doz grubunda azalma belirlendi. Koloni formasyon testi, Matrigel invazyon testi ve yara iyileşme (Wound healing) deneylerinde en etkili kombinasyonun sisplatin+paklitaksel olduğu saptandı. TAS, TOS deneylerinden elde ettiğimiz OSI değerlendirmesinde ALA+sisplatin+paklitaksel üçlü doz uygulanan grupta artış gözlendi. Annexin V ile apoptoz tespiti deneyinde ALA, sisplatin ve paklitaksel ile kombinasyonlarında apoptozu kontrol grubuna oranla belirgin şekilde artırdı; fakat en yüksek artış yine sisplatin+paklitaksel doz grubunda gözlendi. TUNEL ile apoptoz değerlendirmesinde ise apoptotik hücreler en fazla sisplatin+paklitaksel uygulanan grupta bulundu. Çalışmamızın sonuçlarına göre ALA proliferasyon, hücre döngüsü, PI3K -AKT yolağı, tümör hücresi adezyonu, invazyon, migrasyon, apoptoz ve oksidatif stres ile ilgili sinyal yollarının çoğunda birçok basamağı etkiledi, fakat OVCAR-3 hücrelerinde beklediğimiz gibi sisplatin-paklitaksel ikilisinin etkinliğini artırmadı. ALA'nın anti-kanser etki mekanizmalarının daha iyi anlaşılabilmesi için hem in vivo hem de in vitro araştırmalara gereksinim vardır.

Ovarian cancer is the leading cause of gynecological cancer deaths worldwide. The current standardized treatment for ovarian cancer is paclitaxel and platinum-based chemotherapy (KT) with optimal cytoreductive surgery. Resistance and side effects to the most commonly used chemotherapy agents in ovarian cancer, such as cisplatin and paclitaxel, are the difficulties encountered in these treatment protocols. In order to reduce these problems, it is important to search for new drugs that are non-toxic and work in alternative/similar ways to these drugs, thus offering additional treatment options in ovarian cancer. One of these new agents is alpha lipoic acid (ALA), a natural antioxidant. ALA, which is given as an adjunct to treatment in various types of cancer, plays an important role in cellular growth with its ability to scavenge reactive oxygen species (ROS) and regenerate endogenous antioxidants.In this project, it was aimed to investigate the effects of the application of cisplatin, paclitaxel chemotherapeutic agents and ALA antioxidant compound alone or in combination in the OVCAR-3 human ovarian adenocarcinoma cell line. OVCAR-3 human ovarian adenocarcinoma cell line was used in our study. We evaluated the effects on cell viability, IC50 (the half maximal inhibitory concentration) doses with XTT [2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl) 2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide] assay. IC50 doses were found by XTT test and groups were formed. The group names according to the doses are as follows; control, ALA IC50, Cisplatin IC50+Paclitaxel IC50, ALA IC50+ Cisplatin IC50+Paclitaxel IC50. Expressions of genes associated with apoptosis, cell cycle, PI3K (Phosphatidylinositol-3-kinase)-AKT (Serine/Threonine kinase, protein kinase B) pathway and tumor cell adhesions were evaluated by Real-Time Polymerase Chain Reaction (Real-Time PCR, RT-PCR). p-AKT (phosphorylated Akt), p-mTOR (phosphorylated mammalian target of rapamycin), p-FOXO1 (phosphorylated forkhead box O1) and MAPK (Mitogen-activated protein kinase) protein levels were analyzed by ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method. Wound healing experiment (wound healing experiment), matrigel invasion test and colony formation experiments were performed. Total oxidant and total antioxidant levels were evaluated with TAS (Total Antioxidant Status) and TOS (Total Oxidant Status) tests, and oxidative stress index (OSI) values were calculated based on TAS and TOS results and by dividing TOS by TAS. Apoptosis was investigated by Annexin V and TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) methods. Thus, we aimed to reveal the possible therapeutic efficacy of ALA with cisplatin and paclitaxel in vitro.The IC50 values of ALA, cisplatin, and paclitaxel were determined as 83.1 ?M (micromolar), 10.6 ?M, and 19 nM (nanomolar) at 48th hour by XTT test, respectively. According to the RT-PCR results, it was determined that the substances and combination applications had effects on the expression of genes related to apoptosis, cell cycle, PI3K-AKT pathway and tumor cell adhesions. It was determined that ALA suppressed the PI3K-AKT pathway both alone and in the triple dose group with ALA+cisplatin+paclitaxel.According to the results obtained from the ELISA method, the most significant decrease in p-AKT, p-mTOR protein levels was found in the cisplatin+paclitaxel group, while p-FOXO1 and MAPK protein levels were determined in the triple dose group of ALA+cisplatin+paclitaxel. In the colony formation test, Matrigel invasion test and Wound healing tests, it was determined that the most effective combination was cisplatin+paclitaxel. In the OSI evaluation we obtained in TAS and TOS experiments, an increase was observed in the group that received triple dose of ALA+cisplatin+paclitaxel. In the apoptosis detection experiment with Annexin V, combinations of ALA with cisplatin and paclitaxel significantly increased apoptosis compared to the control group; however, the highest increase was observed in the cisplatin+paclitaxel dose group. In the evaluation of apoptosis with TUNEL, apoptotic cells were found the most in the cisplatin+paclitaxel group. According to the results of our study, ALA affected many steps in many of the signaling pathways related to proliferation, cell cycle, PI3K-AKT pathway, tumor cell adhesion, invasion, migration, apoptosis and oxidative stress, but did not increase the efficiency of the cisplatin-paclitaxel couple in OVCAR-3 cells as we expected. Both in vivo and in vitro studies are needed to better understand the anti-cancer action mechanisms of ALA.