Doksorubisinin kardiyotoksik etkisine karşı karvakrol ve C vitamininin kardiyoprotektif etkilerinin in vitro ortamda değerlendirilmesi

Abstract

Doksorubisin ( DOX), hematolojik maligniteler ve solid tümörlerin tedavisinde uzun yıllardır kullanılan antrasiklin türevi kemoterapötik ajanlardandır. Kardiyotoksik yan etkileri klinik kullanımını kısıtlamaktadır. Deneysel çalışmalarda C vitamini ve karvakrolün antioksidan etkileri gösterilmiştir. Çalışmamızd a, patogenezinde oksidatif stresin rol oynadığı doksorubisin ilişkili kardiyotoksisiteyi H9C2 hücre hattı üzerinde modelleyerek C vitamini ve karvakrolün ayrı ayrı ve sinerjist etkilerini araştırmayı amaçladık. Karvakrol ve C vitamininin kardiyoprotektif e tkilerinin, hem kontrol grubu ile hem de doksorubisine maruz kalan hücreler ile değerlendirebilmek amacıyla hücre hatları yedi gruba ayrıldı. Gruplar; kontrol, karvakrol, C vitamini, DOX, DOX+karvakrol, DOX+C vitamini, DOX+karvakrol+C vitamini şeklindeydi. Doksorubisin dozları 1,25 2,5 5 10 20 40 50 60 75 μM olarak belirlendi. Her alt grubun canlılık düzeyi 24., 48. ve 72. saatte ayrı ayrı ölçüldü. Böylece hücrelerin %50’sinin canlı kaldığı IC50 dozları 24.saatte 14,71 μM, 48.saatte 1,186 μM, 72.saate 0,272 μM olarak hesaplandı. Artan DOX dozunun ve geçen zamanın hücre canlılığına olumsuz etkisi görüldü. (p<0,05). Değişken dozlarda karvakrol ve C vitamini verilen gruplarda kontrol grubuna göre hücre canlılığı karşılaştırıldı. C vitamini verilen grupta 24.saatte, karvakrol verilen grupta hem 24. hem 72.saatte kontrol grubuna göre hücre canlılığının istatistiksel olarak arttığı saptandı. (p<0,05). IC 50 dozunda DOX ile birlikte çeşitli dozlarda karvakrol ve C vitamini verilen hücreler sadece IC50 dozunda DOX alan grup ile karşılaştırıldı. DOX+ C vitamini verilen grubun canlılık yüzdesi 24.saatte, DOX+ karvakrol verilen grubun canlılık yüzdesi 48. ve 72. saatte sadece DOX verilen gruba göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde yüksek saptandı (p<0,05). XV Karvakrol ve C vitamininin etkileşimini değerlendirmek amacıyla IC50 dozunda doksorubisin, 100 μM C vitamini kombinasyonuna 20 mM ve 80 mM karvakrol eklemek; IC 50 dozunda doksorubisin 500 μM C vitamini kombinasyonuna 20 mM, 40 mM ve 80 mM karvakrol eklemek hücre canlılığını istatistiksel anlamlı olarak azalttı (p<0,05). Aynı gruplar üzerinde yapılan wound healing testinde karvakrol verilen grubun yara yeri yüzey alanı kontrol grubuna göre anlamlı şekilde küçüldü. (p=0,003). 24.saat analizinde ise kontrol ile karvakrol, kontrol ile C vitamini, DOX ile DOX+karvakrol+C vitamini grupları arasında istatistiksel anlamlı olarak fark saptandı (p<0,05). D Doksorubisin oksorubisin uygulanan gruba 40 mM karvakrol, 200 µM C vitamini ve karvakrol+ uygulanan gruba 40 mM karvakrol, 200 μM C vitamini ve karvakrol+ C vitamini eklenmesinin BAX ekC vitamini eklenmesinin BAX ekspresyonunda azalma ile birlikte spresyonunda azalma ile birlikte kardiyomiyositlerin şeklinin de korunmuş olduğu ve C vitaminin kaspazkardiyomiyositlerin şeklinin de korunmuş olduğu ve C vitaminin kaspaz--3 3 ekspresyonunu azaltarak apoptotik aktiviteyi azalttığı bulunekspresyonunu azaltarak apoptotik aktiviteyi azalttığı bulundudu.. C vitamini ve karvakrolün gerçek C vitamini ve karvakrolün gerçek zzamanlı PCR yöntemi kullanarak BAX, MMPamanlı PCR yöntemi kullanarak BAX, MMP--2, 2, TGFTGF--beta beta faktörlerin gen ekspresyonlarını afaktörlerin gen ekspresyonlarını azzalttığı bulunalttığı bulundudu.. Sonuçlarımız, karvakrol ve C vitamininin doksorubisin ilişkili kardiyotoksisite üzerine ayrı ayrı kullanımlarının kardiyoprotektif etki göstererek faydalı olabileceğini desteklemektedir.

Doxorubicin (DOX) is an anthracycline derivative chemotherapeutic agent used for many years in the treatment of haematological malignancies and solid tumours. Cardiotoxic side effects limit its clinical use. Antioxidant effects of vitamin C and carvacrol have been shown in ex perimental studies. In our study, we aimed to investigate the individual and synergistic effects of vitamin C and carvacrol by modelling doxorubicin induced cardiotoxicity, in which oxidative stress plays a role in the pathogenesis, on H9C2 cell line. The cell lines were divided into seven groups in order to evaluate the cardioprotective effects of carvacrol and vitamin C on both control and doxorubicin exposed cells. The groups were as follows: control, carvacrol, vitamin C, DOX, DOX+carvacrol, DOX+vitamin C, DOX+carvacrol+vitamin C. Doxorubicin doses were determined as 1.25 2.5 5 10 20 40 50 50 60 75 µM. The viability level of each subgroup was measured separately at 24, 48 and 72 hours. Thus, the IC50 doses at which 50% of the cells remained viable were c alculated as 14.71 µM at 24 h, 1.186 µM at 48 h and 0.272 µM at 72 h. Increasing DOX dose and time had a negative effect on cell viability (p<0.05). Cell viability was compared in the groups given varying doses of carvacrol and vitamin C compared to the co ntrol group. It was found that cell viability increased statistically at 24.hour in the vitamin C group and at both 24.and 72.hour in the carvacrol group compared to the control group (p<0,05). Cells treated with various doses of carvacrol and vitamin C to gether with DOX at IC50 dose were compared with the group receiving only DOX at IC50 dose. The percentage of viability of the DOX+ vitamin C group at 24th hour and the percentage XVII of viability of the DOX+ carvacrol group at 48th and 72nd hours were statisti of viability of the DOX+ carvacrol group at 48th and 72nd hours were statistically cally significantly higher than the DOX alone group (p<0.05).significantly higher than the DOX alone group (p<0.05). In order to evaluate the interaction between carvacrol and vitamin C, adding 20 mM In order to evaluate the interaction between carvacrol and vitamin C, adding 20 mM and 80 mM carvacrol to doxorubicin, 100 µM vitamin C combination at IC50 dose and 80 mM carvacrol to doxorubicin, 100 μM vitamin C combination at IC50 dose and adding 20 mM, 40 mM and 80 mMand adding 20 mM, 40 mM and 80 mM carvacrol to doxorubicin, 500 µM vitamin C carvacrol to doxorubicin, 500 μM vitamin C combination at IC50 dose decreased cell viability statistically significantly (p<0.05).combination at IC50 dose decreased cell viability statistically significantly (p<0.05). In the wound healing test performed on the same groups, the wound surface area of In the wound healing test performed on the same groups, the wound surface area of the carvacrol group was significantly smalthe carvacrol group was significantly smaller than the control group (p=0,003). In the ler than the control group (p=0,003). In the 24th hour analysis, there was a statistically significant difference between control and 24th hour analysis, there was a statistically significant difference between control and carvacrol, control and vitamin C, DOX and DOX+carvacrol+vitamin C groups carvacrol, control and vitamin C, DOX and DOX+carvacrol+vitamin C groups (p<0.05).(p<0.05). It was found that the addition of 40 mM It was found that the addition of 40 mM carvacrol, 200 µM vitamin C and carvacrol carvacrol, 200 μM vitamin C and carvacrol + vitamin C to the doxorubicin treated group preserved the shape of cardiomyocytes + vitamin C to the doxorubicin treated group preserved the shape of cardiomyocytes with a decrease in BAX expression and vitamin C decreased apoptotic activity by with a decrease in BAX expression and vitamin C decreased apoptotic activity by decreasing caspasedecreasing caspase--3 expression.3 expression. Vitamin C and car Vitamin C and carvacrol were found to decrease gene expressions of BAX, MMPvacrol were found to decrease gene expressions of BAX, MMP--2, 2, TGFTGF--beta factors using realbeta factors using real--time PCR method.time PCR method. Our results support that the separate use of carvacrol and vitamin C on doxorubicin Our results support that the separate use of carvacrol and vitamin C on doxorubicin--induced cardiotoxicity may be beneficial by showing cardioprotinduced cardiotoxicity may be beneficial by showing cardioprotective effect.ective effect.