Doksorubisin kardiyotoksisitesinde all-trans retinoik asit ve dekspantenolün kardiyoprotektif etkilerinin değerlendirilmesi

Abstract

Hematolojik maligniteler ve solid neoplazilerin tedavisinde kullanılmakta olan doksorubisin (DOX), antrasiklin türevi bir ilaçtır ve uzun yıllardır kullanılması sebebiyle iyi tanımlanmış, kullanımını kısıtlayan yan etkilere sahiptir. Bunlardan birisi olan toksik miyokardit; oksidatif stres, mitokondri fonksiyonlarında bozulma, apoptoz, piroptoz, nekroptoz, ferroptoz ve otofaji yolaklarının uyarımı yoluyla oluşmaktadır. All-trans retinoik asit (ATRA) antioksidan stres yanıtını düzenlediği, mitokondriyal fonksiyonları iyileştirdiği, kardiyomiyosit apoptozunu önlediği bilinen bir maddedir. Dekspantenolün (DEX) ise oksidatif stres, endoplazmik retikulum stresi ve inflamasyon üzerine düzenleyici etkileri vardır. ATRA ile DEX’in fizyolojik mekanizmaları ve DOX’un kardiyotoksik mekanizmalarının birçok ortak yolaktan geçmesi dikkat çekicidir. Biz de H9c2(2-1) hücrelerinde DOX ile oluşturulmuş toksik miyokardit modelinde ATRA ve DEX’in tekli ve birlikte kullanımlarının etkilerini göstermeyi amaçladık. Bu amaçla H9c2(2-1) hücreleri ile 7 farklı grup tasarlandı. Bunlar; kontrol, DOX, DEX, ATRA, DOX+DEX, DOX+ATRA, DOX+DEX+ATRA şeklindeydi. Tasarlanan gruplarda en uygun ilaç dozlarını saptamak için XTT hücre canlılığı testi kullanıldı. DOX için 24, 48, 72. saat IC50 (Yarı Maksimum İnhibisyon Konsantrasyonu) değerleri ayrı ayrı hesaplandı. DEX ve ATRA için ise hücre canlılığını en çok arttıran dozlar seçildi. Ardından hücre-hücre etkileşimi ve hücre migrasyonunu değerlendirmek için Wound Healing (Yara İyileşme, Scratch Assay) deneyi belirlenen dozlarda tüm gruplara uygulandı. Apoptoz yolaklarının değerlendirilmesi amacıyla Kaspas-3, Bax, Bcl-2, TGF-β, TIMP-1,TIMP-2 primer antikorları uygulanıp immunsitokimya değerlendirmesi yapıldı. Hücre hattına Gerçek XVII Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Real Time-PCR, RT-PCR) ve TUNEL testi yapılarak sonuçlar desteklendi. Deney sonuçlarına göre DOX IC50 dozu 24. saat için 14,71 μM, 48. saat için 1,18 μM, 72 saat için ise 0,27 μM olarak belirlendi. XTT sonrasındaki deneyler 24. saat için yapılmış olup; diğer dozlar DEX için 31,25 μM, ATRA için 125 nM olarak seçildi. Hücre canlılığı deneylerinde DEX verilen grubun 7,8 μM ile 250 μM doz aralığında hücre canlılığını %167’ye, ATRA verilen grubun ise 3,9 nM ile 1 μM doz aralığında %170’e kadar çıkardığı saptandı. Ancak 2 μM ve üzerinde ATRA’nın toksik etki gösterdiği görüldü. DOX IC50 ve artan dozlarda DEX uygulanmasında 15,6 μM, 31,25 μM ve 125 μM DEX dozlarında, sadece DOX IC50 grubuna göre hücre canlılığında anlamlı artış izlendi. DOX IC50, artan dozlarda ATRA ile birlikte uygulandığında, ATRA 3,9 nM ile 125 nM arası dozlardayken, DOX IC50 grubuna göre hücre canlılığı anlamlı şekilde daha yüksek seyretti. DOX IC50+DEX ile DOX IC50+ATRA grupları arasında anlamlı fark izlenmedi. IC50 dozunda DOX ile değişen dozlarda ATRA ve DEX birlikte uygulandığı zaman, düşük ve orta doz DEX içeren birleşimlerin istatistiksel olarak anlamlı derecede hücre canlılığını arttırdığı görüldü. Ancak aynı gruplar, DOX+ATRA gruplarına göre yüksek canlılık gösterse de DOX+DEX gruplarına benzer sonuçlar verdi ve sinerjistik etkiye dair kanıt bulunamadı. Yara iyileşmesi ve migrasyon deneylerinde ise DOX IC50 uygulanan grupların hiç birisi kontrol grubunu yakalayamadığı gibi DEX ve ATRA grupları da kontrol grubuna göre anlamlı sonuç vermedi. İmmunsitokimya sonuçlarımızda DOX uygulanan gruplarda artan TGF-β ekspresyonunun arttığı ve DEX ve ya ATRA ile bu etkinin geri çevrilemediği saptanırken, izole DEX uygulanmasının kontrole göre TGF-β ekspresyonunu anlamlı şekilde düşürdüğü izlendi. Kaspaz-3 seviyelerinde ise izole DOX uygulamasına göre hem DEX hem de ATRA uygulanan gruplarda anlamlı düşüşler izlenirken üçlü uygulamanın, ikili uygulamalara bir üstünlüğü saptanmadı. Aynı şekilde DOX uygulanmış gruplarda Bax ekspresyonu hem DEX hem de ATRA tarafından anlamlı şekilde baskılandı. DOX+DEX uygulanan grupta ekspresyon kontrol grubuna yakın seviyelere kadar düştü. Ancak bu etkisi üçlü uygulamadan daha iyiydi ve sinerjistik etki yakalanamadı. DOX+DEX uygulanan gruplarda Bcl-2 ve TIMP1 ekspresyonları XVIII DOX uygulanmış tüm gruplardan anlamlı şekilde daha düşük saptanırken, DOX+ATRA uygulanan grup TIMP2 ekspresyonunu üçlü uygulama dahil tüm gruplardan daha fazla arttırdı. RT-PCR sonuçlarında ise grupların birbirlerine anlamlı farklılıkları izlenmezken DOX+DEX+ATRA uygulanan grubun özellikle BCl-2, TIMP1 ve TIMP2 ifadelerinde anlamlı düşüşler göstermesi dikkat çekiciydi. TUNEL testi sonuçları ise genel olarak önceki sonuçları desteklese de üçlü birleşim grubunda, DOX+DEX ve DOX+ATRA gruplarına göre anlamlı düzeyde apoptotik indeks düşüşü göstermiştir. Sonuçlarımız; dekspantenol ve all-trans retinoik asitin, doksorubisin kardiyotoksisitesi üzerinde önleyici etkisini göstermekle beraber sinerjistik etkiyi göstermek için yeterli veriyi sağlayamamıştır. Deneyler sırasında bazı dozlarda birbirlerinin etkisini arttırırken bazı dozlarda ise toksik etki oluşturdukları gözlenmiştir. Dolayısı ile DEX ve ATRA’nın farklı dozlarda kombinasyonları ile daha fazla sayıda çalışma yapılarak kardiyak koruyucu ve toksisite oluşturucu dozlarının aydınlatılmasına ihtiyaç vardır.

Doxorubicin (DOX), an anthracycline derivative, is a drug used in the treatment of hematologic malignancies and solid neoplasms. Due to its long-term use, its well-defined side effects limit its application. One of these side effects is toxic myocarditis, which occurs through oxidative stress, mitochondrial dysfunction, apoptosis, pyroptosis, necroptosis, ferroptosis, and autophagy pathways. All-trans retinoic acid (ATRA) is known to regulate the antioxidant stress response, improve mitochondrial functions, and prevent cardiomyocyte apoptosis. On the other hand, dexpanthenol (DEX) is known for its regulatory effects on oxidative stress, endoplasmic reticulum stress, and inflammation. The fact that ATRA and DEX share multiple common pathways with DOX's cardiotoxic mechanisms is noteworthy. Therefore, we aimed to demonstrate the effects of ATRA and DEX individually and in combination in a DOX-induced toxic myocarditis model in H9c2(2-1) cells. For this purpose, seven different groups were designed using H9c2(2-1) cells: control, DOX, DEX, ATRA, DOX+DEX, DOX+ATRA, and DOX+DEX+ATRA. To determine the optimal drug doses in these groups, an XTT cell viability assay was employed. The IC50 (half-maximal inhibitory concentration) values for DOX at 24, 48, and 72 hours were calculated separately. For DEX and ATRA, the doses that most effectively increased cell viability were selected. Subsequently, the wound healing (Scratch Assay) experiment was applied to all groups at the determined doses to evaluate cell-cell interactions and cell migration. Caspase-3, Bax, Bcl-2, TGF-β, TIMP-1, and TIMP-2 primary antibodies were used for immunohistochemical evaluation to assess apoptosis pathways. Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) and TUNEL test was conducted to support the results. XX According to the experimental results, the DOX IC50 dose was determined to be 14.71 μM at 24 hours, 1.18 μM at 48 hours, and 0.27 μM at 72 hours. Experiments following the XTT assay were conducted using the 24-hour IC50 dose, while the selected doses for DEX and ATRA were 31.25 μM and 125 nM, respectively. In the cell viability experiments, the DEX group increased cell viability up to 167% within the 7.8 μM to 250 μM dose range, while the ATRA group increased cell viability up to 170% within the 3.9 nM to 1 μM dose range. However, ATRA exhibited toxic effects at concentrations above 2 μM. Upon combining DOX IC50 with increasing DEX doses, cell viability significantly increased at 15.6 μM, 31.25 μM, and 125 μM DEX doses compared to the DOX IC50 group alone. When DOX IC50 was combined with increasing doses of ATRA, cell viability remained significantly higher than the DOX IC50 group at ATRA doses ranging from 3.9 nM to 125 nM. No significant difference was observed between the DOX IC50+DEX and DOX IC50+ATRA groups. When DOX IC50 was combined with increasing doses of both ATRA and DEX, combinations containing low and moderate doses of DEX significantly increased cell viability. However, while these groups demonstrated higher cell viability than DOX+ATRA groups, they showed similar results to DOX+DEX groups, and no synergistic effect was observed. In the wound healing and migration experiments, none of the DOX IC50-treated groups reached the level of the control group, nor did the DEX and ATRA groups show significant results compared to the control group. Our immunohistochemistry results showed that increased TGF-β expression in DOX-treated groups was not reversed by DEX or ATRA, while isolated DEX application significantly reduced TGF-β expression compared to the control. Regarding Caspase-3 levels, both DEX and ATRA-treated groups showed significant reductions compared to the isolated DOX group; however, triple combination therapy showed no superiority over dual applications. Similarly, Bax expression was significantly suppressed by both DEX and ATRA in DOX-treated groups. DOX+DEX treatment resulted in Bax expression levels close to the control group, which was superior to the triple combination, with no evidence of a synergistic effect. Bcl-2 and TIMP-1 expression levels in DOX+DEX-treated groups were significantly lower than in all DOX-treated XXI groups, while the DOX+ATRA group exhibited the highest TIMP-2 expression, even exceeding the triple combination group. In RT-PCR results, no significant differences were observed between groups, although the DOX+DEX+ATRA group notably showed significant reductions in Bcl-2, TIMP-1, and TIMP-2 expression levels. Although the TUNEL assay results generally supported the previous findings, a significant decrease in the apoptotic index was observed in the triple combination group compared to the DOX+DEX and DOX+ATRA groups. Our results demonstrate that dexpanthenol and all-trans retinoic acid exhibit protective effects against doxorubicin cardiotoxicity; however, sufficient evidence for synergistic effects was not obtained. During the experiments, some doses enhanced each other's effects, while others showed toxic effects. Therefore, additional studies are required to explore the cardioprotective and toxic doses of DEX and ATRA in various combinations.